拓扑替康对早幼粒白血病细胞增殖凋亡的影响

张静　 王景　 王晋

摘 要：目的： 拓扑替康对早幼粒白血病细胞增殖凋亡的影响；方法： 应用四甲基偶氮唑盐（MTT）光吸收法分别检测0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的TPT分别作用于HL-60细胞后12小时、24小时、36小时、48小时细胞增殖情况，计算增殖抑制率。结果：采用MTT法检测在同一浓度TPT在不同时间点对HL-60细胞的抑制作用随时间的延长而增强，与对照组相比较，均有统计学意义（P<0.05）。结论：拓扑替康对HL-60细胞具有增殖抑制作用。

关键词：拓扑替康 细胞增殖 凋亡

中图分类号：R9 文献标识码：A 文章编号：1003-9082（2018）07-0-02

拓扑替康（TPT）以DNA拓扑异构酶Ⅰ为作用靶点的半合成喜树碱衍生物，是一种新药，呈水溶性，目前已广泛应用于多种实体瘤的治疗及试用于恶性血液系统疾病的治疗[1]，并取得较好疗效。白血病是血液系统最常见的恶性肿瘤，近年来发病率越来越高，死亡率也很高[2]，这就严重影响了国民健康。但是随着联合化疗的不断发展，骨髓移植术的不断提高，免疫治疗及基因治疗的不断改善[3]，急性白血病的治疗效果明显得到了很大的提高。

一、材料与方法

1.材料

1.1细胞株

人源性白血病细胞系HL-60细胞，由中国协和医科大学肿瘤研究所提供。

1.2 实验药物

TPT（注射用盐酸拓扑替康）：四季青有限公司。

2.方法

2.1细胞培养

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2饱和湿度下的恒温箱中进行常规培养，平均2-3天换液一次，细胞生长良好，取倍增期的细胞进行实验。

2.2实验分组

2.2.1细胞培养

选取生长状态良好、在倍增期的HL-60细胞进行实验分组，共分为两组：对照组和实验组，对照组不加用任何浓度的拓扑替康，实验组分别加用0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L及0.8?mol/L浓度的拓扑替康，选取作用时间为12h、24h、36h和48h。

2.2.2四甲基偶氮唑盐光吸收法

用新鲜配制RPMI1640培养基把细胞配制成单个细胞悬液，在96孔培养板中接种，每孔5×104个细胞200?l量，并设置平行孔。

向实验组中分解加入0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的拓扑替康，在对照组应加入同等量的生理盐水。加药后经过12h、24h、36h、48h分别作用后，每孔加入20?l的MTT溶液，不弃去培养基的条件下，放入37℃和5%CO2孵育箱内孵育4小时，等待检测。将每组每孔细胞均匀轻轻细细吹打，混匀，移入1.5mlEP管中，离心，再在每孔中加入二甲基亚砜150?l，轻轻摇荡10min，使其完全得到溶解。然后将混合液再次置入96孔板中，将96孔板放入酶标仪中，选择波长490nm处，检测各孔的光吸收值，记录结果并把结果打印。根据该结果计算增殖抑制率，抑制率=（1-实验组值/对照组值）×100%来实现的，根据增殖抑制率的结果得出细胞的最适作用浓度和最适作用时间。

二、结果

不同浓度的TPT在不同时间点对HL60细胞生长抑制的MTT结果。

分别采用0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的TPT研究在不同时间点（12h、24h、36h、48h）对HL-60细胞的抑制作用，MTT结果显示各浓度值的抑制细胞增殖作用均随作用时间的延长而增强，各组与对照组相比较，均有统计学意义（P<0.05）。同一浓度TPT在不同时间点抑制率两两比较，除36h和48h两时间点的抑制率比较无统计学意义外（P>0.05），余各时间点对HL-60细胞的抑制率均有统计学意义（P<0.05）。

同一时间点不同浓度的TPT（0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L）对HL-60细胞的增殖抑制作用隨着浓度增高而增强，各组与对照组相比较（P>0.05），各浓度组均具有统计学意义（P<0.05）；进一步对同一时间不同浓度组两两之间比较，除0.4?mol/L与0.8?mol/L药物浓度组在同一时间点抑制率无统计学意义（P>0.05）外，余各浓度组在同一时间点不同浓度两两比较均有统计学意义（P<0.05）。

由上述可见，TPT对HL-60细胞生长有抑制作用，其抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性，其作用的最佳时间和最适浓度分别为36h和0.4?mol/L（见表1）。后续试验均采用0.4?mol/LTPT作用36h的HL-60细胞。

三、讨论

拓扑替康（TPT）是1996年在美国上市的半合成抗肿瘤新药，在临床上已开始使用，它的临床作用机制和其它喜树碱药物是相似的，因此具有喜树碱类药物共同的药理作用，它是细胞内一种特异性的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂已被确定。

近年来，随着分子诊断学、分子药理学和分子肿瘤学共同的迅猛发展，各种医学技术的提高，也促使在白血病等恶性血液病的治疗方面也已进入到综合治疗时代，但最基础最主要的治疗方法仍然是化疗，综合治疗手段包括联合化疗和免疫治疗，也包含基因治疗和造血干细胞移植治疗等相关治疗手段。DNA拓扑异构酶（topoisomerase）是一种对核酸空间结构 实时动态进行调节的一种关键酶，拓扑异构酶能够对核酸生理功能有主导作用，有Ⅰ型拓扑异构酶（ Topo Ⅰ） 和Ⅱ型拓扑异构酶（ Topo Ⅱ） 两种类型。所表现出来的生物学作用主要通过下述方式来体现，一：调节控制DNA的超螺旋状态，使其不断进行变化，并且控制DNA打结，控制DNA解结，使这两种环链体状态也发生不断变化，进而不直接地影响波及细胞内核酸代谢过程，导致细胞代谢过程紊乱。二：不间接参和核糖核酸的重组、修复、转录等基因的合成过程，还直接加入核糖核酸的复制过程。DNA拓扑异构酶Ⅰ（Topo Ⅰ）是一种单亚基蛋白，位于20号染色体上，分子量为100kD，它参与DNA复制、转录、重组和修复等所有关键的过程[4]，是生物体内及其重要的细胞核内酶。研究显示[5]TopoⅠ在非异常的组织中其含量稳定不变，即使是细胞正处于增殖期时候，Topo Ⅰ也会保持在静止期的两倍的范围之内，但在恶性肿瘤组织中，Topo Ⅰ含量显著上升。基于上述原理，出现了很多以Topo Ⅰ为靶点的与Topo Ⅰ抑制剂相关的药物，现已将这些药物运用到治疗小细胞肺癌、卵巢癌等实体恶性肿瘤中，当然还有恶性血液病上，临床疗效也被证实疗效不错。近年来，已被很多学者公认为喜树碱衍生物和紫杉醇和维甲酸类化合物这三样药物，具有时代标志意义，三者共同被称为了20世纪90年代抵抗恶性肿瘤药物的三大标志性发现[6]。在美国国立癌症研究所（NCI）中，药物机制分析电脑网络系统存在有被称为所谓的六大抗肿瘤药物，其中Topo Ⅰ抑制剂就是六大抗肿瘤药物的其中之一，被列入各国重点药物研究。如何从天然产物（植物、海洋生物等）中寻找新的化学结构、克服耐药性及不良反应是新的细胞毒类抗肿瘤药的发展目标。

該研究观察了显微镜下细胞所发生的形态学变化，检测了利用MTT法得到的对细胞的增殖抑制率，（表一）本研究通过MTT法探讨了拓扑替康对HL-60细胞的增殖抑制的时间和浓度方面进行了实验。检测所得的数据显示：同一时间点不同浓度的TPT对HL-60细胞的抑制作用，随着浓度的升高，拓扑替康的抑制作用显得越来增强，与对照组进行统计学分析，差异均达到统计学意义的标准（P<0.05）。

在细胞周期中，拓扑替康于DNA复制前期就特异性地与DNA单链断端上的拓扑异构酶Ⅰ发生特异性结合，阻止了拓扑异构酶Ⅰ修复单链断端，破坏DNA双链结构，最终导致肿瘤细胞死亡。拓扑替康具有广谱抗肿瘤活性[7]，在治疗非霍淋巴瘤、肠癌、肺癌和卵巢癌等各种恶性肿瘤中，拓扑替康已显示出了有较好的疗效。

参考文献

[1]Beran M， Kantarjian H， et al. Topotecan， a topoisomerase I inhibitor， is active in the treatment of myelodysplastic syndrome and chronic myelomonocytic leukemia. Blood，1996，88（7）：2473-2479

[2]张莉萍，蒋纪恺，刘祥贵. DNA 拓扑异构酶及其抑制剂与细胞调亡. 国外医学临床生物化学与检验学分册，1997 ，18 （4） ：181-183

[3]Vey N， Kantarjian H， BeranM， et al. Combination of topotecan With cytarabine or etoposide in patients with refractory or relapsed Acute myeloid leukemia： results of a randomized phaseⅠ/Ⅱstudy. Invest New Drugs，1999，17（1）：89-95

[4]Erler JT， Cawthome CJ， Williams KJ， et al. Hypoxia-mediated down-regulation of Bid and Bax in tumors occurs via hypoxia-inducible factor-1-dependent and –independent mechanisms and contributes to drug resistance [J]. Mol Cell Biol， 2004， 24（7）： 2875-2889.

[5]Cabanill as F. The role of topoisomerase-Ⅰinhibitors in the treatmentof non-Hodgkin′s lymphoma. Semin Hematol， 1999，36[4] ：12-14.

[6]刘秀峰， 秦叔逵， 王琳等，恩度与化疗联合治疗多种晚期恶性肿瘤的临床观察[J].临床肿瘤学杂志， 2007 ， 12（4） ：240.

[7]Vaupel P， Mayer A. Hypoxia and anema： effects on tumor biology and treatment resistance. Transfus Clin Biol， 2005，12（1）：5-8.