核干细胞因子表达对HL—60细胞的影响

刘芳怡　贾文倩

摘 要：目的：核干细胞因子表达对HL-60细胞的影响；方法： 采用逆转录-PCR（RT-PCR）方法检测NS基因及蛋白在HL-60白血病细胞中的表达。结果：RT-PCR检测结果显示 NS在白血病细胞系HL-60中呈表达状态。结论： NS在白血病细胞系HL-60中表达。

关键词：核干细胞因子 HL-60细胞 影响

中图分类号：R-01 文献标识码：A 文章编号：1003-9082（2018）07-0-02

白血病是血液系统最常见的恶性肿瘤，近年来发病率越来越高，死亡率也很高，这就严重影响了国民健康。但是随着联合化疗的不断发展，骨髓移植术的不断提高，免疫治疗及基因治疗的不断改善，急性白血病的治疗效果明显得到了很大的提高。有研究报道核干细胞因子在正常造血系统的造血干细胞中发现，在成熟细胞和淋巴细胞没有发现它的踪迹；白血病细胞是些不分化的幼稚细胞，无限增殖克隆，因此，NS在白血病细胞可发现，但目相关关NS在白血病细胞表达的研究不多甚至少有。能不能通过抑制NS蛋白在白血病细胞中表达从而阻止细胞的增殖方式尚有待进一步研究，TPT对白血病细胞的抗肿瘤作用与NS基因的表达之间是否存在相关的关系有待进一步探索。

一、材料与方法

1.材料

1.1细胞株

人源性白血病细胞系HL-60细胞，由中国协和医科大学肿瘤研究所提供。

2.方法

2.1细胞培养

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2飽和湿度下的恒温箱中进行常规培养，平均2-3天换液一次，正常情况下细胞生长悬浮成团，大小较均一，光滑圆润，细胞膜完整，生长状态良好，取2X106的细胞进行实验。

2.2提取RNA

2.2.1参照TRIZOL提取试剂盒说明书，依次进行下列步骤。

（1）首先把待检细胞收集一起，然后在离心机上离心各组细胞。然后用PBS洗涤两次，将洗后的细胞移入1.5mlEP管中，该EP管不含RNase，离心转速1000转每分，离心5min，弃去上清液。

（2）在每个EP管中加入提取试剂盒中的 TRIZOL试剂，并混匀，在低温离心机中离心。

（3）在4℃离心机中取出离心好的EP管，放置室温，5min，使混合物物充分溶解。然后在每管中加入氯仿试剂200μl，包埋EP管中内样品，将EP管在振荡机上高速振荡，混匀，放置室温5分钟，然后放置在4℃低温离心机中置离心，12000rpm ，15min，此时，EP管中液体开始分为两层：上层无色，成为水相；下层粉红色，称为苯酚氯仿相。

（4）转移上层无色水相，于洁净的无RNase的1.5mlEP管中，然后再加入0.5ml异丙基醇，慢慢混匀，放置室温静放10min，可见到白色絮状沉淀物形成，放置在4℃离心机中离心，离心速度为12000rpm，离心时间为10min。

（5）离心后，可见沉积在管壁或管底的絮状物，即为RNA沉淀，弃去EP管中的上清液体，加入1ml浓度为 75%的乙醇，乙醇内应不含RNase，随即旋转充分上下摇匀，然后再放置4℃离心机中离心5min，转速为7500rpm。

（6）再次溶解：离心后，取出EP管，轻轻弃去上层离心清液，然后将此EP管置于无菌操作台内，待其自然凉干，风干。每管加入不含RNase的处理后的三蒸水水，放于55℃水浴锅内10min，等待RNA完全溶解其中后，分装，保存在-70℃冰箱备用。

以上所使用仪器均已过DEPC水浸泡处理，以上所有步骤均需谨慎避免被RNase污染。

2.2.2 RNA的完整性及含量测定

测定RNA完整性：取5?l上述步骤提取的RNA样品，在15g/L琼脂糖凝胶中电泳，琼脂糖中含6%甲醛，电压8V/cm，30分钟后，取出凝胶，在凝胶扫描成像系统下观测电泳结果并拍照。

测定其中RNA含量：单链RNA定量采用分光光度法，取5?l RNA样品，稀释至100?l后加在比色杯中，放置于紫外分光光度仪内检测260nm波长下吸光光度值和280nm波长下吸光光度值，进行下列计算：（1） 单链RNA的纯度：纯的单链RNA OD280/OD260比值在溶液中的正常参考范围为1.8～2.0。若此OD比值低于了1.6，则说明样品不纯，样品极大程度可能被蛋白质或酚等杂质所污染，应丢弃不用，再进一步重复上述步骤抽提RNA。（2） 单链RNA的浓度的计算：在分光光度仪上波长为260nm下，1OD260=40?g/ml的单链RNA。此时我们可按下述公式计算单链RNA含量：单链RNA含量（?g/?l）=OD260（波长为260nm时的光度值）×所稀释的倍数×40?g/1000?l。

2.2.3 cDNA的制备

cDNA的制备通过购买试剂盒并参照试剂盒说明书进行下列步骤：

（1）在取好的碎冰上放置若干无RNase 0.5mlEP管，然后在各管中加入由上述步骤提取好的5?lRNA，并加入随机引物1?l和ddH2O 6?l。

（2）用手轻轻上下左右摇动混匀上述物质，在离心机上以12000r/min离心5s，取出放在70℃水浴锅中水浴5分钟，然后取出快速放于备好的碎冰上冷却，再在离心机上以12000r/min离心5s。

（3）低温下放于碎冰时向各EP管依次加入：5×buffer 4?l、RNasin 1?l 、10mM dNTP 2?l，加好后混匀，再于离心机上以12，000r/min离心5s，然后放置室温（25℃）下，或在水浴锅中温育5min。

（4）RevertAidTM M-MuLV reverse transcriptase（200U/?l） 1?l，加到各EP管中，总体积20?l。

（5）12000rpm离心5s，25℃水浴中放置10min，然后放置调好温度为42℃的水浴中育60min。

（6）再放置在温度为70℃的水浴锅中水浴10min，此时反应终止，取出放置在碎冰上冷却，备下列中步骤所用或-20℃冻存备用。

2.2.4 PCR反应

（1）取0.2ml新扩增管，要灭菌处理，本实验所选取的PCR扩增体系是25?l的扩增体系，此扩增体系中共包含下列试剂：

将加进去的物质混匀，离心机内以12000rpm离心5s，然后放进DNA热循环扩增仪进行PCR扩增，经过设定好的程序后等待扩增结果。

（2）NS扩增程序和步骤：95℃进行预变性5min，94℃进行变性30s，56℃发生退火30s，72℃进行延伸50s，经历31个循环，再在72℃延伸5min。

二、结果

RT-PCR检测结果显示 NS在白血病细胞系HL-60。

根据RT-PCR的电泳结果可见：NS扩增片段大小为418bp。内参β-actin扩增片段长度为315bp，各組电泳条带没有发生任何变化。对于RT-PCR产物的电泳结果，在HL-60细胞中核干细胞因子（NS）基因中mRNA表达。

三、讨论

核干细胞因子（nucleostemin，NS）[1]是一个正性调节蛋白，参与细胞增殖过程。NS不表达于终末分化细胞中，在肿瘤细胞恶性增殖和凋亡逃逸发挥作用。研究发现[2，3]，NS通过多条途径阻碍细胞分化，影响细胞周期，从不同方面促进肿瘤进展。目前，通过对NS基因的更加深入研究，人们对肿瘤的发生机制有了更深层次的了解，这对肿瘤的诊断、治疗及预后评估将产生较深远的影响。

本研究结果显示：通过RT-PCR实验表明NS基因在HL-60细胞中是高表达状态， RT-PCR结果显示NS基因在HL-60细胞中表达。也有研究表明[64]，NS可能在细胞周期中干细胞和癌细胞穿越G2/M调控点的决定方面是一个特异性因子，由于它仅表达于干细胞和恶性肿瘤细胞中，而白血病既是干细胞疾病又是恶性肿瘤，因此在白血病细胞中研究NS基因和NS蛋白也比较合适，而TPT是Topo-Ⅰ的抑制剂，具有广谱抗肿瘤作用，其作用机制也并不十分完全明了，因此，TPT有可能通过下调NS基因而达到抗白血病作用可能为其作用机制之一。岳保红[4]等人研究表明，NS基因在急性白血病中呈高表达状态，这种高表达状态在研究中得到了证实，表达特点是处于不同分化阶段的白血病[5]细胞表达在该基因水平表达高低也有一定的差别，健康人和良性贫血患者没有发现该基因的高表达现象。所以白血病[6]是一种造血干细胞的恶性克隆性疾病，它的发生已被总结为是一个多基因、多阶段、多步骤的发病过程。

参考文献

[1]钱晖，许文荣，王文兵，韩崇旭，郝顺祖，朱伟，孙晓春，胡嘉波，黄诒森；骨髓间充质干细胞和部分肿瘤细胞中Nucleostemin基因的表达[J]；中国生物化学与分子生物学报；2005，1：3-4

[2]刘秉乾，王广有，李沛寰，范志强，王海涛，马腾骧；Nucleoste min基因在膀胱移行细胞癌中的表达及其意义[J]；中华实验外科杂志；2005，1（2）：120-121

[3]岳保红，孙玲，赵小强，等.核干细胞因子基因在急性白血病细胞表达的检测和意义[J]，中华检验医学杂志，2006，29（ 4）： 324

[4]岳保红，朱晓燕，张功员，等.核干细胞因子基因沉默对H L-60细胞分化特征的影响[J].郑州人学学报：医学版，2007，42（ 4）： 657

[5]许晓巍， 许小平， 陈少谊等. 三氧化二砷诱导多药耐药白血病细胞K562-n/VCR凋亡. 白血病·淋巴瘤， 2005，14（2）：4-6

[6]Philips，R.L， Ernst，R.E， Brunk， B. et al. The genetic program of hematopoietic stem cells. Science. 2000，288： 1635-1640.