Aβ25—35诱导PC12细胞凋亡影响

蔡弘扬　王晋

摘 要：目的： 观察Wnt3a对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的影响。方法：以Aβ25-35 （30 μmol/L）诱导PC12 细胞氧化应激损伤，MTT法测定细胞的存活率，倒置显微镜观察细胞的形态。结果：在PC12细胞的培养过程中，采用MTT法测定细胞的存活率，PC12 细胞依赖Wnt3a浓度的增加而存活率升高，在浓度100 ng/ml时达到最佳值。结论：Wnt3a对Aβ25-35诱导的PC12 细胞损伤具有保护作用。

关键词：Wnt3a PC细胞 细胞损伤 氧化应激

中图分类号R285 文献标识码：A 文章编号：1003-9082（2018）07-0-02

随着社会老龄化进程的加快，阿尔茨海默病（AD）的发病率和发病人数急剧上升。传统的药物治疗，如使用改善脑循环药物、能量代谢促进剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂等，疗效有限[1]。因而，研究AD发病机制，并针对病因进行分子水平的治疗，将成为改善阿尔茨海默病症状、治愈AD的新思路。

神经损伤及凋亡是阿尔茨海默病的病理机制，氧化应激损伤在神经退行性病变中具有重要的病因学意义[2]。研究表明，线粒体裂变或者聚变，都可以对细胞产生氧化损伤[3]，也可能产生局部生物能量的缺乏。目前，已有较多的证据表明，线粒体形态的异常或功能的缺陷，会导致神经细胞的损伤或者死亡。因而，线粒体作为细胞的一个中央细胞器是潜在治疗AD的新靶点[4]。但是，在AD的发病机制中，是否与一些线粒体功能的缺陷而导致的发病存在联系，尚不清楚[5]。

一、材料和方法

1.材料

1.1细胞大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞来自中国科学院细胞所。

1.2试剂：DMEM培养基（ Gibcol），胎牛血清（ 四季青），Wnt3α（Sigma）

2.方法

2.1 PC-12细胞的体外培养 PC-12细胞接种于培养瓶，置于37℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。完全培养基为DMEM添加15%小牛血清。每3 d换液1次，3～4 d以1：5进行传代。

2.2 PC-12细胞的Aβ25-35诱导和Wnt信号通路干扰 Aβ25-35 （Sigma）100 ?mol/L，过滤并分装后，贮存于-20℃。使用前在37℃温箱孵育7天，并用新鲜的完全培养基稀释为工作浓度10 ?mol/L、20 ?mol/L、 30 ?mol/L、40?mol/L和50 ?mol/L。对数生长期的PC-12细胞，消化并离心收集后，重悬在完全培养基中，以5×105/cm2的密度接种在培养瓶和六孔板表面生长。待细胞长至80%融合时，去除培养基，并加入新鲜培养基，其中含梯度浓度（10～50?mol/L）Aβ25-35，置于上述条件的培养箱中培养。加药24 h，收集细胞进行检测。为了观察Wnt信号通路及线粒体的缺陷的影响，确定实验Aβ25-35 30 ?mol/L培养基中加入经典Wnt通路的激活Wnt3a 50 ng/ml、100 ng/ml 和200 ng/ml，48 h以后收集细胞进行观察和检测。

2.3按照处理因素对细胞分组

实验设4组，每组6个样本（n=6）。各组处理如下。组1使用完全培养基；组2使用完全培养基+Aβ25-35 30 ?mol/L+ Wnt3a 50 ng/ml；组3为完全培养基+Aβ25-35 30?mol/L+Wnt3a 100 ng/ml；组4为完全培养基+Aβ25-35 30 ?mol/L+ Wnt3a 200 ng/ml。

2.4 用新鲜配制RPMI1640培养基把细胞配制成单个细胞悬液，在96孔培养板中接种，每孔5×104个细胞200?l量，并设置平行孔。2.5向实验组中分解加入同上分组Wnt3a的剂量，在对照组应加入同等量的生理盐水。加药后经过12h、24h、36h、48h分别作用后，每孔加入20?l的MTT溶液，不弃去培养基的条件下，放入37℃和5%CO2孵育箱内孵育4小时，等待检测。将每组每孔细胞均匀轻轻细细吹打，混匀，移入1.5mlEP管中，离心，再在每孔中加入二甲基亚砜150?l，轻轻摇荡10min，使其完全得到溶解。然后将混合液再次置入96孔板中，将96孔板放入酶标仪中，选择波长490nm处，检测各孔的光吸收值，记录结果并把结果打印。根据该结果计算增殖抑制率，抑制率=（1-实验组值/对照组值）×100%来实现的，根据增殖抑制率的结果得出细胞的最适作用浓度和最适作用时间。

二、结果

我们采用大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞株建立AD细胞模型。体外培养的PC12细胞，对实验中的各项检测，均选取低代数（小于P5）、对数生长期细胞进行分离培养和药物处理。

本实验采用顺梯度浓度的Aβ25-35与 PC12 细胞共培养孵育24 h， Fig. 1A 所示细胞活力随着Aβ25-35浓度的递增而降低，结合细胞形态观察，本实验选取30?mol/L作为Aβ25-35诱导AD细胞模型的适宜浓度，及进行后续研究。

细胞接种 24 h 后除对照组外其余均加入30 μmol/LAβ25-35，同时除建造的AD模型组外其余加入不同浓度（ 50、100、200 ng/ml） Wnt3a 48 h， 如 Fig. 1B 所示PC12 细胞依赖Wnt3a浓度的增加而存活率升高，在浓度100 ng/ml时達到最佳值。

Fig.1

MTT法测定PC12细胞凋亡（ n = 6）. *P < 0. 05， **P< 0. 01 vs 对照组（Aβ25-35= 0）.

结合细胞形态观察，本实验选取30?mol/L作为Aβ25-35诱导AD细胞模型的适宜浓度。在此实验中，建立AD模型的PC12 细胞通常在接种24 h时开始接受处理，即：去除原培养基，更换为含Aβ25-35（30 mol/L）的新鲜培养基，持续作用24 h，每个实验组分别加50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml Wnt3a持续到48 h。观察细胞形态及生长情况如图（Fig.2）。

A AD模型 B AD+wnt3a（50ng/ml） C AD+wnt3a（100ng/ml） D AD+wnt3a（200ng/ml）

Fig.2：PC12在倒置显微镜下细胞形态

三、讨论

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，临床表现包括进行性记忆减退，认知功能障碍等，并伴有机体内大量的大脑皮质和海马区神经细胞的丢失。机体在新陈代谢过程中持续生成各种类型的氧自由基代谢产物，并且通过各种抗氧化酶将自由基进行清除，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶等。此外，各种环境污染物、紫外线照射等也是氧自由基的重要来源[6]。机体的氧化损伤即机体内产生的氧自由基得不到及时清除，导致活性氧在体内堆积引起细胞毒性，是机体各组织老化的重要诱因。AD 病人体内自由基生成增加，尤其是脑组织中神经细胞的氧化应激是导致其脑结构和功能改变的原因之一[7]。

基于上述讨论，我们推测AD发病中，线粒体的缺失或者异常导致细胞的氧化损伤，以至于导致细胞的凋亡。通过影响Wnt信号通路，改变Aβ对细胞的毒性作用，以减少对细胞的氧化损伤。其中，Wnt信号通路中的wnt3a蛋白发挥着主要作用。

Aβ是AD发病的始动因素，长期以来也是AD治疗的重要靶标。一方面Aβ能够影响细胞骨架的完整性。另一方面，Aβ的细胞毒性作用可能干扰线粒体的功能障碍，β-淀粉样蛋白积聚而成的毒性肽链与过氧化氢酶相互作用，令过氧化氢酶丧失正常功能，导致培养基内的神经细胞受到氧化损伤如图（Fig.1 、Fig.2）。

本实验利用MTT法检测细胞的增殖活力间接测线粒体酶的活力反映细胞活力， 结果表明浓度超过20?mol/L Aβ25-35与 PC12 细胞孵育 24 h 能明显抑制WST-1代谢率，说明Aβ25-35释放毒性对细胞线粒体功能造成障碍；Wnt3a能浓度依赖性改善WST-1代谢率，在Wnt3a100ng/ml达到最佳值， 表明Wnt3a对Aβ25-35释放毒性造成的线粒体损伤具有保护作用（Fig.1），形态学观察表明30?mol/L Aβ25-35与 PC12 细胞孵育24 h 细胞形态发生改变有菱形变成了扁形，表明细胞发生损伤； Wnt3a在50 ng/ml和100 ng/ml细胞的形态明显得到了改善，表明Wnt3a能增加存活细胞数目如图（Fig.2）。

氧化应激理论认为，由细胞内的线粒体经呼吸作用产生的天然副产物——不断积累的有害性活性氧自由基（ROS）不但可损害各种分子（包括蛋白质、脂质与核酸），而且还会随着时间的积累对细胞功能产生有害影响[8]。近期研究表明，有一条路径机制与淀粉样蛋白无关。“坏的”ApoE4会分解形成有毒的碎片，这些碎片会捣毁细胞的能量工厂—线粒体—从而改变细胞构架。

虽然究竟什么才是最终引起细胞凋亡及死亡的特异性生物化学事件依然存在争议，但是我们已经知道的是，在细胞培养中，如果找到存在的适当浓度的“矫正”分子，就会减少线粒体的损害以及神经元紊乱的发生。目前，研究者正在动物模型中对这些分子进行更加严格的检测。如果最终证明这些分子在人体内是安全和有效的，那么我们就终于看到了曙光。

参考文献

[1]Hardy J ， Selkoe DJ. The amyloid hypothesis of Alzheimers disease： progress and problems on the road to therapeutics[J]. Science， 2002，297： 353-356.

[2]Maxwell SR. Prospects for the use of antioxidant therapies[J].Drugs，1995，49：345-361.

[3]KageyamaY， Zhang Z， Roda R.， et al. （2012）. Mitochondrial division ensures the survival of postmitotic neurons by suppressing oxidative damage. J. Cell Biol. 197， 535–551.

[4]Lin M.， Beal F.. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature 2006 443， 787–795.

[5]张大鹏，王奇.阿尔茨海默病发病中淀粉样β蛋白的神经毒性作用。中国临床康复，2005. 9（25）：174-176

[6]Itoh K.， Nakamura K.， Iijima M.，et al. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration.Trends Cell Biol. 2013.23， 64–71.

[7]黃欣，柳川. 以Aβ为靶标治疗阿尔茨海默病的研究进展。生物技术通讯，2005.16（1）：87-89

[8]Chan D. C.. Fussion and Fission： interlinked processes critical for mitochondrial health. Annu. Rev. Genet. 2012.46， 265–280.