外周血循环hTERT mRNA和CK19 mRNA的表达与鼻咽癌肿瘤微转移的相关性研究*

付新洒,曹彦洋，李冠雪，陈 芳，王晓琪， 杨梦雪，蔡智谋，钟庆雯，文 忠，申聪香△

(1.南方医科大学珠江医院耳鼻咽喉-头颈外科，广州 510282；2.中国人民解放军第四一一医院耳鼻咽喉科，上海 200081；3.南方医科大学珠江医院小儿耳鼻咽喉科，广州 510282)

鼻咽癌属于上皮源性低分化或未分化恶性肿瘤，尽管近年在诊断和治疗上均取得了较大进展，但综合预后仍然很差，其总体5年生存率小于50%[1]，致死的主要原因是局部复发和远处转移。外周循环血肿瘤细胞微转移是复发转移的前提，目前临床上缺乏敏感又特异度高的液体活检手段。近年研究表明，肿瘤在侵袭和转移的早期阶段,就可能有肿瘤细胞侵入外周循环血中[2]，而进入外周循环血液的肿瘤细胞仍可表达多种肿瘤特异性蛋白并释放入循环血中。国内外已有许多学者报道用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)的方法检测出肿瘤患者外周血微量癌细胞,它通过扩增能在肿瘤细胞中特异性表达而在其他血液细胞中不表达的特异性mRNA，从而实现在外周循环血中检测到循环肿瘤细胞(CTCs)及其游离mRNA。这种方法已经应用于肺癌、前列腺癌等血液肿瘤细胞微转移的研究[3-4]。上述研究提示，实时检测循环血中CTCs及其释放循环血中的特异性游离mRNA对判断肿瘤早期微转移及指导临床治疗具有重要意义。而与肿瘤有密切关系的端粒酶及其人端粒酶逆转录酶(hTERT)亚单位成为理想的检测指标。本研究通过qRT-PCR法检测鼻咽癌肿瘤患者外周循环血hTERT mRNA 表达情况并联合检测上皮性肿瘤标志物细胞角蛋白19(CK19) mRNA，分析二者在鼻咽癌患者外周循环血中的表达意义及与肿瘤细胞血液微转移的关系，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本 鼻咽癌组纳入2013年9月至2014年6月南方医科大学珠江医院耳鼻喉科收治的鼻咽癌患者，共44例，年龄23～72岁，平均49岁。患者均经病理学确诊为低分化型鳞状细胞癌且既往未经任何治疗。TNM分期采用鼻咽癌2008临床分期标准：Ⅰ期5例，Ⅱ期6例，Ⅲ期19例，Ⅳ期14例；T1期患者11例，T2期13例，T3期14例，T4期6例；N05例，N16例，N224例，N39例；M039例，M15例。同时，收集健康体检者外周血标本20例作为对照组。本研究通过了南方医科大学珠江医院医学伦理委员会审核批准，病理标本的采集和检测试验均经患者知情同意。

1.1.2主要试剂与仪器 淋巴细胞分离液(天津TB公司)，TRIZOL(美国Invitrogen公司)，PrimeScript RT reagent Kit 逆转录试剂盒(日本Takara公司)，SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒(日本Takara公司)，ABI7500 荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.2方法

1.2.1血标本处理 鼻咽癌Ⅰ、Ⅱ期患者直接行放疗，Ⅲ、Ⅳ期行两个疗程诱导化疗后再行放疗，治疗前及放疗结束后于上午6:00～9:00点采集外周静脉血，采血时第1管血弃之不用，取第2管血5 mL置入真空无菌肝素抗凝的试管。2 h内加入淋巴细胞分离液(比重1.077)离心2 500 r/min，20 min 后收集界面细胞，得到单个核细胞层(癌细胞在此层)，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，置-80 ℃保存。对照组血标本处理同鼻咽癌组。

1.2.2引物序列 内参β-action引物及CK19 mRNA及hTERT引物采用Primer express设计，引物序列如下。CK19：上游引物5′-TGG AAG AGT GTC TGG AGC AA-3′，下游引物5′-GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3′；hTERT：上游引物5′-CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA-3′，下游引物5′-GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3′；β-action：上游引物5′-TGA CAC CTC ACC TCA CCC AC-3′， 下游引物5′-CAC TGT CTT CCG CAA GTT CAC-3′。引物由上海生工公司合成。

1.2.3qRT-PCR 300 μL单个核细胞加入1 000 μL Trizol试剂进行RNA提取，用紫外分光光度计检测总RNA水平，A260/A2801.8～2.0视为抽提的RNA纯度高，-80 ℃保存。分别取总RNA 1 μg，按反转录试剂盒说明书逆转录反应合成cDNA，以反应所得cDNA 进行PCR 扩增。反应体系：SYBR Premix 10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL和灭菌去离子水7.8 μL共20.0 μL。反应条件：预变性95 ℃ 30 s；PCR反应：95 ℃变性15 s；60 ℃退火20 s，72 ℃延伸34 s，40个循环。以β-action作为内参照，试验重复3次。

1.2.4结果判断 qRT-PCR由荧光定量PCR仪自动采集目的基因与内参基因的Ct值，基因表达量用鼻咽癌组/对照组(2-△△Ct)计算。

2 结 果

2.1两组hTERT mRNA 和CK19 mRNA比较 试验结果显示，对照组外周血中CK19 mRNA相对表达量为0.85±0.50，鼻咽癌患者外周血中CK19 mRNA水平为10.97±4.60，差异有统计学意义(t=-14.39,P<0.01)。对照组外周血中hTERT mRNA相对表达量为1.09±0.40，鼻咽癌患者外周血中hTERT mRNA水平为10.45±3.81，差异有统计学意义(t=-16.64,P<0.01)，见图1～2。

2.2hTERT mRNA 和CK19 mRNA与鼻咽癌临床病理因素的关系 鼻咽癌患者外周血hTERT mRNA和CK19 mRNA的表达与临床分期、T分期、N分期、M分期有明显相关性(P<0.05),见表1。

图1 hTERT mRNA 在鼻咽癌和对照组的相对表达量

图2 CK19 mRNA 在鼻咽癌和对照组的相对表达量

项目nCK19 mRNAF/tPhTERT mRNAF/tP临床分期20.24<0.0131.73<0.01 Ⅰ53.88±1.204.38±1.43 Ⅱ67.03±0.617.05±1.29 Ⅲ1911.27±2.5711.19±1.84 Ⅳ1414.78±4.2514.03±2.87N分期18.59<0.0126.64<0.01 N053.88±1.204.38±1.43 N167.03±0.617.05±1.29 N22412.08±3.8911.73±2.15 N3914.97±4.6014.18±3.30T分期12.26<0.019.24<0.01 T1116.85±3.187.72±3.75 T21310.24±3.529.72±3.03 T31412.42±3.1312.30±2.05 T4616.88±4.3014.70±3.55M分期4.590.038-3.700.020 M03910.46±4.1410.38±3.87 M1514.96±6.5013.64±1.40

2.3hTERT mRNA和 CK19 mRNA与鼻咽癌治疗疗效的关系 Ⅰ、Ⅱ期共11例患者直接行放疗，Ⅲ、Ⅳ期共33例患者行两个疗程诱导化疗后再行放疗。治疗后CK19 mRNA 由10.97±4.60降低至5.63±1.91；hTERT mRNA由10.75±3.81降为5.46±2.00。治疗后CK19 mRNA和 hTERT mRNA表达量均明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨 论

肿瘤血行微转移是近年的研究热点，血行转移也是鼻咽癌远处转移的主要途径之一，早期发现外周血肿瘤细胞微转移可筛选出具有转移倾向的高危肿瘤患者，对于预测肿瘤外周血微转移及临床治疗方案的选择和预后的判断具有重要意义。

细胞角蛋白(CK)表达于正常上皮和上皮源性肿瘤。正常情况下，血液中不存在CK，如果外周血中检测出CK，提示上皮源性肿瘤已经转移入血。CK19 是国内外公认的的上皮性组织特异性标志物，已被广泛应用于乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌等上皮性肿瘤外周血中微转移的检测，有很高的灵敏度和较好的特异度[5-10]。hTERT是端粒酶催化亚基，与端粒酶一样仅在肿瘤细胞中高表达，在对照组织中不表达，研究提示，hTERT与鼻咽癌关系密切，是癌变的早期事件[11-12]。因为端粒酶系统与恶性肿瘤的特异性关系，采用检测肿瘤患者外周循环血中hTERT mRNA成为肿瘤患者血液活检的重要方法，对于判断血液微量CTCs存在的微转移提供了重要线索，已显示出有前景的临床利用价值[13]。

本研究采用qRT-PCR技术检测鼻咽癌患者外周血中CK19 mRNA和hTERT mRNA的表达，分子生物学水平预示血液中可能存在的微量CTCs及释放的特异性肿瘤标志物，对早期发现鼻咽癌外周血微转移提供试验依据，这有可能彻底改变目前临床主要依靠影像学、病理学检测肿瘤复发和远处转移的局限性、滞后性，有助于早期发现血液转移高危患者。本研究结果发现已经发生远处转移的患者，CK19 mRNA 和hTERT mRNA的表达较未转移者明显升高。这也证实了本课题组对于肿瘤微转移是肿瘤真正转移发生的前奏的猜测。同时本研究还发现，鼻咽癌患者外周血CK19 mRNA和hTERT mRNA的表达与临床分期、T分期、N分期有相关性。即使是早期鼻咽癌患者，也可见CK19 mRNA和hTERT mRNA升高，说明鼻咽癌患者在癌症的早期就可能在外周血出现肿瘤细胞并进一步形成微转移,且随着临床分期的进展而更趋明显,与文献[5,7]报道一致。因而，外周血hTERT及CK19 mRNA检测亦对指导临床治疗有很大帮助。

但也有文献报道，并非发现外周CTCs就说明出现转移，可能由于外周循环中肿瘤细胞受机体免疫系统的限制，绝大多肿瘤细胞并不能形成转移灶，但是肿瘤发生转移率却明显上升[5,7]。也有能在肿瘤微转移发生中，必须达到一定的量变才会出现肿瘤真正远处转移的质变。其机制有待于深入研究。

目前评判鼻咽癌的治疗效果方面尚缺乏有效的临床检测指标，外周血CK19mRNA和hTERT mRNA检测在评判恶性肿瘤的治疗效果方面显示出了潜在的重要价值。GEORGOULIAS等[6]研究显示，乳腺癌外周血CTCs中CK19 mRNA的阳性率经过3个疗程化疗后由66.8%降低至47.8%，6个疗程化疗后，阳性率降低至44.3%。本研究的试验结果也发现，治疗后CK19 mRNA 由10.97±4.60降低至5.63±1.91；hTERT mRNA由10.75±3.81降为5.46±2.00，治疗后CK19 mRNA和hTERT mRNA表达量均明显下降。二者有可能成为鼻咽癌早期血液转移及治疗效果评估的标志物。

综上所述，通过外周血 CK19 mRNA和hTERT mRNA的检测可能对传统的鼻咽癌TNM分期进行补充以在早期发现肿瘤微转移，更有效地指导临床治疗。本研究结果已初步显示远处转移患者CK19 mRNA 和hTERT mRNA的表达较未转移者明显升高。因此，有必要进行大样本量的前瞻性对照研究，以阐明其与鼻咽癌微转移的关系，为鼻咽癌的诊治提供新的参考指标。