靶向干扰Livin对HEC-1-A细胞侵袭迁移能力的影响*

王晓华，张玉娟

(承德医学院附属医院妇科，河北承德 067000)

子宫内膜癌发病率逐年上升，早期患者经外科手术治疗预后较好，但晚期患者的中位生存时间不超过1年[1]，侵袭转移是影响晚期肿瘤患者生存率的重要因素。Livin基因是凋亡蛋白抑制因子(IAPs)家族中的一员，目前对Livin的研究主要集中在其抗细胞凋亡方面，而对子宫内膜癌细胞侵袭及迁移能力的影响目前鲜有报道。本研究应用RNA干扰技术特异性下调Livin基因表达水平，观察Livin对人子宫内膜癌细胞株(HEC-1-A)细胞侵袭及迁移能力的调控作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 HEC-1-A细胞株购自广州吉妮欧公司。

1.1.2小分子干扰RNA 特异性小分子干扰RNA(Livin-siRNA)和阴性对照序列(Livin-NC)由苏州吉玛公司设计合成。

1.1.3主要试剂 Lipofectamine 2000、SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG购自美国Invitrogen公司；Trizol 购自美国Ambion公司；Takara RNA PCR TM KIT(AMV)Ver.3.0购自日本TaKaRa公司；Livin、β-actin兔多克隆抗体购自英国Abcam公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel matrix Basement membrane购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1细胞转染 在转染前24 h将细胞以1×105/mL密度接种在6孔板中，使转染期间细胞丰度为30%～50%。根据Lipofectamine 2000说明进行转染试剂的制备。试验分为Livin-si组(转染Livin-siRNA干扰序列)、Livin-NC组(转染Livin-NC阴性对照序列)和Livin-B组(正常培养的HEC-1-A细胞)。转染6 h后弃去原培养基，更换为含10%胎牛血清(FBS)培养基继续培养。

1.2.2qRT-PCR检测Livin mRNA表达 转染后48 h，用预冷却的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤6孔板中的细胞2次，Trizol法提取细胞总RNA。由大连宝生物公司设计合成目的基因Livin及内参基因GAPDH的引物序列(表1)。根据Takara RNA PCR TM KIT(AMV)Ver.3.0说明书逆转录合成cDNA第1条链，应用SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG 试剂盒进行qRT-PCR反应。反应条件：95 ℃ 3 min共1循环，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40循环，然后95 ℃ 1 min、60 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s进行熔解曲线分析。应用2-△△ct方法计算目的基因相对表达量。

表1 Livin和GAPDH引物序列

1.2.3Western blot检测Livin蛋白表达 转染后48 h收集各组细胞，将蛋白裂解液加入细胞沉淀中并在冰浴中孵育30 min。BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量后，取50 μg进行凝胶电泳，分离蛋白并电转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，二抗(1∶3 000)孵育1 h。电化学发光(ECL)超敏化学发光液显影，Tanon 6100化学发光图像分析系统进行成像分析，目的蛋白Livin与内参蛋白β-actin的光密度比值计算Livin的相对表达量。

1.2.4Transwell小室侵袭及迁移试验 使用Coring的小室模型，Matrigel基质胶1∶5稀释后每个小室100 μL均匀包被小室基底膜。收集转染48 h后各组细胞，加入DMEM培养基制备单细胞悬液，调整细胞密度至4×105/mL，上室加入100 μL细胞悬液，下室加入600 μL 含20%FBS培养基。培养36 h甲醇固定，结晶紫染色，树胶封片。显微镜下观察6个视野细胞数量计数取平均值，每组3个小室。迁移试验不用包被Matrigel基质胶，培养箱孵育时间为26 h，其余同细胞侵袭试验。

2 结 果

2.1qRT-PCR检测转染后Livin mRNA表达情况 Livin-si组与Livin-NC组、Livin-B组比较，Livin mRNA相对表达量明显减少，差异有统计学意义(F=95.976,P=0.007)；Livin-NC组与Livin-B组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1 转染后3组细胞Livin mRNA比较

2.2Western blot检测转染后Livin蛋白表达情况 Livin-si组比较Livin-NC组、Livin-B组，Livin蛋白相对表达量明显较少，差异有统计学意义(F=603.705,P=0.002)；Livin-NC组与Livin-B组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2、3。

A：Livin-si组；B：Livin-NC组；C：Livin-B组

图2 3组细胞Western blot蛋白条带

图3 转染后3组细胞Livin蛋白表达比较

2.3干扰Livin表达后细胞侵袭及迁移能力变化 Transwell小室侵袭试验中，Livin-si组与Livin-NC组、Livin-B组比较，穿膜细胞数明显减少，差异有统计学意义(F=41.026,P=0.001)。迁移试验中，与Livin-NC组和Livin-B组相比，Livin-si组穿膜细胞数同样明显减少，差异有统计学意义(F=42.058,P<0.01)，见图4～6。

A:Livin-si组；B：Livin-NC组

图4干扰Livin表达后细胞侵袭能力变化(结晶紫染色，×200)

A:Livin-si组；B：Livin-NC组

图5干扰Livin表达后细胞迁移能力变化(结晶紫染色，×200)

图6 干扰Livin表达后3组穿膜细胞数比较

3 讨 论

子宫内膜癌发病率逐年上升且呈低龄化趋势发展，尤其是Ⅱ型内膜癌因其更具有早期侵袭转移的倾向，临床预后更差，控制其浸润和转移则成为临床治疗中亟待解决的问题[2-3]。目前对于恶性肿瘤的治疗方法，除了手术和放化疗外，基因靶向治疗为恶性肿瘤的治疗提供了新的方向[4]。基因靶向治疗的策略是通过制备正常基因代替存在遗传缺陷的基因，或关闭、抑制异常基因的表达。

Livin是IAPs家族的成员，编码Livin的杆状病毒IAP重复序列7(BIRC7)基因位于人类染色体20q13.3上，长度为46 kb，包含7个外显子和6个内含子。 研究表明Livin在淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、乳腺癌、胃肠肿瘤、肝癌、肺癌、宫颈癌等一些肿瘤组织中特异性高表达[5-11]。孙炯等[12-14]研究发现Livin在子宫内膜癌中存在异常高表达，并且与子宫内膜癌的分期、病理分级、淋巴结转移显著相关。大量的研究报道主要是针对Livin基因促进肿瘤细胞增殖、抑制其凋亡的作用。然而，最近的研究表明Livin不仅参与了肿瘤细胞的抗凋亡机制，同时还在肿瘤细胞的侵袭及转移过程中发挥作用[15-16]。LIU等[17]研究表明，Livin可以促进肝癌 HepG2细胞的侵袭及转移能力。ZHAO等[18]研究发现，Livin在胃癌BGC832 细胞的侵袭转移中发挥了重要作用，干扰Livin表达可明显抑制BGC832 细胞的侵袭转移能力。

本课题选择生物学行为更具侵袭性的HEC-1-A细胞(中低分化腺癌)作为研究对象，构建Livin的小分子干扰RNA，转染细胞后，qRT-PCR和Western blot分析评估Livin mRNA和蛋白质的表达水平。研究结果表明，用Livin-siRNA转染的HEC-1-A细胞Livin表达水平下调，表明所选靶序列的有效性。抑制Livin表达后，HEC-1-A细胞的侵袭和迁移能力明显减弱。CHEN等[19]研究显示，在前列腺癌PC-3、DU-145细胞系中，Livin是通过NF-κB信号通路调节大分子糖蛋白FN，进而调节前列腺癌细胞的侵袭能力。但Livin调节HEC-1-A细胞侵袭及迁移能力的具体分子机制目前尚不明确，是否也通过上述信号通路调节尚需进一步研究证实。

综上所述，Livin在子宫内膜癌的侵袭及转移中发挥了一定的作用，干扰Livin表达可以为子宫内膜癌的靶向治疗提供一定的理论依据。