脑胶质瘤中磷脂酰肌醇3—激酶、蛋白激酶B及同源磷酸酶—张力蛋白表达水平

施振华 裘五四 程军 姜启周 王卫民 秦智勇

[摘要] 目的 探讨PI3K、AKT、PTEN在脑胶质瘤中的表达。 方法 选择2017年1～12月在我院及华山医院手术治疗的脑胶质瘤患者66例的病理标本进行分析，另选择50例患者的正常脑组织病理标本为参照。应用免疫组化方法检测磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B及同源磷酸酶-张力蛋白表达，比较脑胶质瘤组织中以及正常脑组织中三者的表达水平，分析脑胶质瘤组织中三者阳性表达的相关性。 结果 PI3K及AKT在正常脑组织的阳性表达率显著低于低级别脑胶质瘤及高级别脑胶质瘤，差异有统计学意义（P<0.05）；低级别脑胶质瘤显著低于高级别脑胶质瘤，差异有统计学意义（P<0.05）。正常脑组织PTEN蛋白阳性率100.0%，显著高于低级别脑胶质瘤与高级别脑胶质瘤，差异有统计学意义（P<0.05）；低级别脑胶质瘤显著高于高级别脑胶质瘤，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 PI3K、AKT在脑胶质瘤中呈高表达，PTEN呈低表达，且与恶性程度有关。

[关键词] 磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）；蛋白激酶B（AKT）；同源磷酸酶-张力蛋白（PTEN）；脑胶质瘤

[中图分类号] R739.41 [文獻标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）14-0001-03

[Abstract] Objective To investigate the expression of PI3K， AKT and PTEN in gliomas. Methods The pathological specimens of 66 glioma patients who underwent surgery in our hospital and Huashan Hospital from January to December 2017 were analyzed， and another 50 normal pathological specimens were selected as reference group. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of phosphatidylinositol 3-kinase， protein kinase B and homologous phosphatase-tensin. The expression of three indicators between glioma tissues and normal brain tissues was compared to analyze the correlation between the three positive expressions in glioma tissues. Results The positive expression rates of PI3K and AKT in normal brain tissue were significantly lower than those in low-grade gliomas and high-grade gliomas， and the difference was significant（P<0.05）. And the positive expression rates of PI3K and AKT in the low-grade gliomas were significantly lower than those in high-grade gliomas， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The positive rate of PTEN protein in normal brain tissue was 100.0%， which was significantly higher than that in low-grade glioma and high-grade glioma， with significant difference（P<0.05）. And the positive rate of PTEN protein in the low malignant glioma was significantly higher than that in high grade glioma， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion PI3K and AKT are highly expressed and PTEN is low-expressed in gliomas， which is related to the degree of malignancy.

[Key words] Phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）； Protein kinase B（AKT）； Homologous phosphatase-tensin（PTEN）； Glioma

胶质细胞是分布在中枢与周围神经系统中的支持细胞，包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和无突胶质细胞。脑胶质瘤是神经系统最常见的肿瘤，恶性胶质瘤约占原发性恶性脑肿瘤的70%，年发病率大约5/100 000，每年新发病例超过14 000例，65岁以上人群中发病率明显增高。临床上有三高一低，发病率高，复发率高，死亡率高，治愈率低。脑胶质瘤的临床症状根据发病部位不同而不同，临床诊断主要依赖影像学，磁共振波谱成像可用于胶质瘤与脓肿、炎症及其他非肿瘤性疾病的鉴别诊断。脑胶质瘤的治疗采用以手术切除为主，结合放疗、化疗等综合疗法。PI3K-Akt是一条经典的信号途径，蛋白激酶B（AKT）在细胞存活和凋亡中起重要作用[1，2]。同源磷酸酶-张力蛋白（PTEN）基因是一种新发现的抑癌基因，PTEN蛋白能够通过去磷酸化参与细胞调控，许多癌基因的产物都是通过磷酸化而刺激细胞生长[3，4]。本研究分析脑胶质瘤中PI3K、AKT、PTEN的表达，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

选择2017年1～12月在我院及复旦大学附属华山医院手术治疗的脑胶质瘤患者66例的病理标本进行分析。66例患者中，男37例，女29例，年龄18～69岁，平均（44.8±16.1）岁；低级别32例，高级别34例。另选择50例患者的正常脑组织病理标本为参照，其中男27例，女23例，年龄20～60岁，平均（43.6±15.5）岁。

1.2实验指标及方法

1.2.1 仪器 恒温箱、高压锅、石蜡包埋机、石蜡切片机、显微镜。

1.2.2试剂 兔抗人多克隆抗体PI3K，兔抗人多克隆抗体AKT，鼠抗人单克隆抗体PTEN，DAB显色剂。

1.2.3检测方法 采用免疫组化方法，连续切片，烤箱中60℃，6 h；脱蜡，梯度酒精脱水，阻断内源性过氧化物酶活性，加兔抗人多克隆抗体PI3K（或兔抗人多克隆抗体AKT，或鼠抗人单克隆抗体PTEN），孵育30 min，滴加二抗，孵育30 min，滴加DAB显色液，苏木素复染，脱水，透明，封片；PBS替代一抗为阴性对照。

1.3结果判断[5]

均表达在胞浆。阳性率计分：0分为阳性率为0，1分为阳性率1%～10%，2分为11%～50%，3分为51%～80%，4分为>80%；显色程度计分：0分为无显色，1分为浅棕黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。两者乘积判断阴性或阳性：乘积为0为阴性，1～2分为弱阳性，3～4分为阳性，>4分为强阳性。

1.4统计学方法

采用SPSS15.0统计学软件对数据进行分析，计数资料采用χ2检验，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，相关性分析采用Spearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PI3K在正常脑组织及低级别脑胶质瘤、高级别脑胶质瘤中的表达

见表1。PI3K在正常脑组织的阳性表达率显著低于低级别脑胶质瘤及高级别脑胶质瘤，差异有统计学意义（χ2=20.707，5.823，P<0.05）；低级别脑胶质瘤显著低于高级别脑胶质瘤，差异有统计学意义（χ2=8.059，P<0.05）。

2.2 AKT在正常腦组织及低级别脑胶质瘤、高级别脑胶质瘤中的表达

见表2。AKT在正常脑组织的阳性表达率显著低于低级别脑胶质瘤、高级别脑胶质瘤，差异有统计学意义（χ2=23.468，37.129，P<0.05）；低级别脑胶质瘤显著低于高级别脑胶质瘤，差异有统计学意义（χ2=7.131，P<0.05）。

2.3 PTEN蛋白在正常脑组织及低级别脑胶质瘤、高级别脑胶质瘤中的表达

见表3。正常脑组织PTEN蛋白阳性率100.0%，显著高于低恶性脑胶质瘤与高恶性脑胶质瘤，差异均有统计学意义（χ2=24.139、46.577，P<0.05）；低恶性脑胶质瘤显著高于高恶性脑胶质瘤，差异有统计学意义（χ2=4.855，P<0.05）。

2.4脑胶质瘤组织中三者表达相关性分析

见表4。PI3K与AKT呈显著正相关的关系（r=0.389）；PI3K与PTEN呈显著负相关的关系（r=-0.559）；PI3K与PTEN呈显著负相关的关系（r=-0.571）。

3讨论

PI3K家族调控细胞的生长及代谢，活性升高与癌症有关。磷脂酰肌醇PI在细胞膜组分中占比例小，但在脑细胞膜中的含量丰富[5，6]。PI3K磷酸化PI，形成的产物影响细胞的功能。单磷酸化能刺激细胞迁移，二磷酸可促进细胞的增殖以及对抗凋亡[7，8]。三磷酸化能够调节细胞粘附、生长及存活[9，10]。PI3K-Akt是经典的信号通路，AKT活化后可磷酸化多种激酶以及转录因子，发挥调节细胞功能的作用[11]。AKT激活底物，促进肌细胞对葡萄糖的吸收增加。GSK3β被AKT磷酸化后活性被抑制，导致葡萄糖代谢增加，调节细胞周期。AKT磷酸化TSC1/2能够阻止后者对小G蛋白Rheb的负调控，使Rheb富集，活化mTOR复合体，蛋白翻译被激活，促使细胞生长。AKT还有抗凋亡的作用。IkB激酶可以被ATK激活，导致IκB的降解，后者能够抑制NF-κB，被降解后导致NF-κB释放，靶基因激活，细胞凋亡被抑制。BADBcl-2家族成员，被AKT磷酸化后，阻止其结合Bcl-XL诱发的凋亡。AKT还能够抑制caspase-9的活性，抑制凋亡级联反应的激活[12]。p53是一种肿瘤抑制因子，调控DNA修复、凋亡、细胞周期。p53结合蛋白MDM2可被Ak磷酸化， p53活性受到影响，p53蛋白降解增加，影响细胞存活。PI上有5个位点可以被磷酸化，第4位与第5位可以被多种激酶磷酸化，尤其在质膜内侧，多磷酸化这两个位点进行修饰。磷酸酶C作用于PIP2，生成DAG与肌醇三磷酸。PI3K将一个磷酸基团转移至第3位点，形成单磷酸肌醇，能够刺激细胞的迁移，而未发生磷酸化的肌醇三磷酸没有这种作用。肌醇二磷酸能够促进细胞增殖，对抗细胞凋亡，肌醇三磷酸调节细胞生长、粘附及存活。三类PI3K结构以及功能不同。针对Ⅰ类的研究较多，是异源二聚体，调节亚基的结构域可结合相应的靶点蛋白，催化亚基共有4种，在各种细胞中广泛分布，δ仅出现在白细胞内。生长因子、信号传导物等可激活PI3K，这些因子激活RTK，导致自磷酸化。多种蛋白含有PH结构域，可结合PI-3，4-P2等，可控制蛋白与膜结合的位置、时间，调节蛋白活性，这种相互作用还会改变蛋白构想从而改变蛋白的功能。PI3K被激活后，在质膜上产生PIP3第二信使，与细胞内信号蛋白上的PH结构域结合，使AKT蛋白磷酸化而被活化，其他底物还有蛋白激酶C等。AKT是PI3K的主要下游效应物。AKT活化后，可视多种酶、激酶、转录因子等发生磷酸化，调节细胞功能。AKT能够促进葡萄糖代谢，其激活底物AS160，促进肌细胞吸收葡萄糖。AKT可通过磷酸化GSK3β来抑制其活性，促进葡萄糖代谢，调节细胞周期。AKT是TSC1/2磷酸化阻滞其对Rheb的负调控作用，使后者聚集，激活蛋白翻译，促进细胞生长。AKT通过磷酸化下游靶蛋白发挥抗凋亡的作用。AKT通过IκB激酶的磷酸化，导致IκB降解，而IκB是NF-κB抑制剂，进而导致后者大量蓄积、释放、核转移，抑制细胞凋亡，促进细胞存活。

PTEN是一個关键磷酸酶，在多种肿瘤中发生基因突变或基因缺失。PTEN作为PIP3-磷酸酶，与PI3K功能相反，通过去磷酸化PIP3生成PI-4、5-P2[13，14]。PTEN减少AKT活化，阻止由AKT调控的下游事件。PTEN通过产生PIP2发挥的功能不仅是对抗AKT的作用。PIP2是磷脂酶Cβ的底物，第二信使为DAG和IP3，能够导致细胞内钙离子水平升高，激活蛋白激酶C。PIP2与膜结合，能增加多种离子通道活性。PIP也参与到膜泡的形成以及细胞骨架与膜的相互作用过程中。且PIP2能影响多种脂代谢相关酶的活性。

本研究中，脑胶质瘤组织中PI3K与AKT呈高表达，且高级别脑胶质瘤中的阳性表达率超过90.0%，显著高于低级别脑胶质瘤组织；脑胶质瘤组织中PETN呈低表达，在正常脑组织中阳性率为100.0%，而在脑胶质瘤组织中呈低表达，尤其在高级别脑胶质瘤组织中，阳性表达率更低。与既往的研究结果相似[15]。此结果提示PI3K与AKT可能参与了脑胶质瘤的发生，且与恶性程度有关，其可以成为潜在的治疗靶点。PTEN蛋白的表达缺失或下降导致抑癌能力下降，与肿瘤的发生也有关系[16-20]。

综上所述，PI3K与AKT在脑胶质瘤组织中呈高表达，其可能成为潜在的治疗靶点；PI3K与AKT、PENT呈负相关的关系，提示PENT可能拮抗PI3K与AKT的作用。

[参考文献]

[1] 姚鹏，杨大伟，胡大荣.PI3K/Akt在丝裂霉素诱导肝干细胞凋亡中的作用[J].中华肝脏病杂志，2015，23（3）：200-203.

[2] 韦柳婷，冯洁，莫书荣.PI3K-Akt信号通路与肿瘤相关性的研究进展[J].肿瘤学杂志，2014，20（4）：331-336.

[3] 周炜洵，梁智勇，高洁，等.子宫内膜上皮内肿瘤形态学诊断及PTEN蛋白表达情况[J].中华病理学杂志，2009， 38（6）：393-396.

[4] 张国欣，钱忠义，杨丽娟，等.结直肠腺癌中PTEN和NDRG1的表达及其与预后的关系[J].中华病理学杂志，2017，46（4）：240-244.

[5] 王雪莹，李照梅，周运生，等.Akt激酶抑制剂MK-2206诱导U2OS人骨肉瘤细胞凋亡与自噬[J].中国病理生理杂志，2014，30（9）：1580-1583.

[6] 李若彤，王丽，曹亭，等.Perifosine通过抑制PI3K/Akt途径调节人胶质瘤U251细胞增殖、凋亡与自噬[J].中国病理生理杂志，2016，32（4）：644-650.

[7] 王洪亮，刘国跃，徐乐，等.miRNA-21对PI3K/AKT通路影响的研究进展[J].重庆医学，2017，46（12）：1701-1703.

[8] 刘英，宗志红，刘国良.肌肉素对胰岛素诱导大鼠分化的成肌细胞摄取葡萄糖过程中PI3K和AKT的干预作用[J].中国新药杂志，2007，16（19）：1585-1588.

[9] 解婕，吴振华，胡夕春.乳腺癌中PI3K通路生物标记物的临床疗效预测[J].中国新药杂志，2014，23（24）：2943-2947.

[10] 何磊，季璐璐，沈施仁，等.PI3K/Akt信号途径在二氮嗪抑制缺氧-复氧大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡中的意义[J].江苏医药，2013，39（14）：1624-1626.

[11] 李鹏，张庆九，马法，等.PI3K、Akt和mTOR在无功能性垂体腺瘤中的表达[J].河北医科大学学报，2015，56（9）：1064-1068.

[12] 余跃伟，夏春.软骨细胞凋亡与PI3K/Akt途径及相关信号分子的研究进展[J].临床骨科杂志，2009，12（4）：457-460.

[13] 万晗星，谢睿，刘菁菁，等.尿苷三磷酸通过PTEN/Vimentin抑制胃癌细胞的侵袭[J].第三军医大学学报，2016， 38（6）：550-553.

[14] 李楠，米伟阳，史永强，等.胶质瘤组织中miR-221表达量与PTEN/Akt信号通路、EMT相关基因表达的相关性[J].海南医学院学报，2016，22（20）：2369-2372.

[15] 邓如明. PI3K，AKT，PTEN 在脑胶质瘤中的表达及其临床意义[D].苏州大学，2010：10-11.

[16] 徐丽超，吴英杰.子宫内膜样腺癌中PTEN、MDM2表达及临床意义[J].黑龙江医药科学，2015，38（3）：118-119.

[17] Goel A，Arnold CN，Niedzwiecki D，et al.Frequent inactivation of PTEN by promoter hypermethylaton in microsatellite instability-high sporadic colorectal cancers[J].Cancer Res，2004，64（9）：3014-3021.

[18] Baeza N，Weller M，Yonekawa Y，et al.PTEN methylation and expression globlastomas[J].Acta Nenropathol（Berl），2003，106（5）：479-485.

[19] Schondorf T，Ebert MP，Hoffmann J，et al.Hypermethylation of the PTENGene in ovarian cancer cell lines[J].Cancer Lett，2004，207（2）：215-220.

[20] 张伟峰，杨维良，王夫景，等.PTEN基因在胃癌中的表达及其意义[J].中华实验外科杂志，2003，20（5）：468-469.

（收稿日期：2018-01-22）