HPLC-DAD法测定复合维生素B片中5种组分的含量

2018-08-28胡晓琴

长治学院学报 2018年2期

胡晓琴，韩春

（长治学院化学系，山西长治 046011）

复合维生素B片（Vitamin B Compound Tablets）处方源于《卫生部颁药品标准》化学药品及制剂第一册 WS1-73（B）-89[1]，由维生素 B1（Vitamin B1）、维生素 B2（Vitamin B2）、烟酰胺（Nicotinamide）、维生素 B6（Vitamin B6）和泛酸钙（Calcium Pantothenate）等5种功效组分加工而成，临床用于预防和治疗B族维生素缺乏导致的营养不良、口角炎、神经系统等疾病[2]。现行质量标准《卫生部颁药品标准》化学药品及制剂第一册WS1-73（B）-89分别使用重量法测定维生素B1、分光光度法测维生素B2、滴定法测烟酰胺[1]，方法操作繁琐、误差较大，并且未对维生素B6和泛酸钙进行评价。现有文献中常用高效液相色谱法或超高效液相色谱法测定维生素B1、维生素B2、烟酰胺和维生素B6含量[3-12]；但未见同时测定复合维生素B片5种有效组分的报道，且对于该药中泛酸钙的含量测定报道甚少。本研究采用HPLC-DAD法，选择以乙腈缓冲液（6 mmol/L己烷磺酸钠，1 mmol/L庚烷磺酸钠混合溶液，用冰醋酸调节pH值至4.5）（20:80）为流动相，同时测定复合维生素B片5种有效组分，可为复合维生素B片质量控制提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

岛津LC-20AT型高效液相色谱仪，配有SPD-M20A二极管阵列检测器（DAD）和LabSolutions色谱工作站（日本岛津公司）。维生素B1（批号：100390-201505，含量：100%，100 mg/支）、维生素B2（批号：100369-201504，含量：100%，100 mg/支）、烟酰胺（批号：100115-201604，含量：100%，100 mg/支）、维生素 B6（批号：100116-201404，含量：100%，100 mg/支）、泛酸钙（批号：100370-201402，含量：100%，100 mg/支）均购自中国食品药品检定研究院。复合维生素B片（山西 ****有限公司，批号：140602、140603、140604、140605、140606、140607、160102、160706）；甲醇、乙腈为色谱纯，冰乙酸、无水乙醇为分析纯，盐酸为优级纯，水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈缓冲液（6 mmol/L 己烷磺酸钠，1 mmol/L庚烷磺酸钠混合溶液，用冰醋酸调节 pH 值至 4.5）（20:80）；柱温：30℃；流速：1 ml/min；进样量：10 μL；检测波长：265 nm（维生素B1、维生素B2和烟酰胺）和210 nm（维生素B6和泛酸钙）。

1.3 溶液配制

对照品储备液：分别精密称取维生素B1对照品24.32 mg、维生素B2对照品12.53 mg、烟酰胺对照品80.46mg和泛酸钙对照品10.25 mg，置10 ml量瓶中，加适量1%冰醋酸，振摇溶解后定容，作为对照品储备液（1）；另精密称取维生素B6对照品15.87 mg，置100 ml量瓶中，加适量1%冰醋酸，振摇溶解后定容，作为对照品储备液（2），避光低温保存。

对照品溶液：分别精密量取上述对照品储备溶液（1）1.0 ml、对照品储备溶液（2）2.0 ml，置 25 ml量瓶中，加1%冰醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

供试品溶液：取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于3mg维生素B1），置50 ml量瓶中，加入1%冰醋酸 40 ml超声（300 W，45 kHz）处理15 min，放冷，用1%冰醋酸定容，用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，避光保存。

2 结果与分析

2.1 系统适用性试验

精密吸取“1.3”项下的混合对照品溶液和供试品溶液，按“1.2”项下色谱条件进样分析，记录色谱图（如图1）。由图1可知，供试品与对照品中维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B6和泛酸钙色谱峰的保留时间相对应。维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B6和泛酸钙的保留时间分别为11.3 min、9.2 min、6.3 min、7.6 min 和 3.6 min。

图1 供试品溶液和对照品溶液色谱图

2.2 线性试验

分别精密吸取“1.3”项下对照品贮备液（1）0.05 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml分别置 5 ml量瓶中，依次加入“1.3”项下对照品贮备液（2）0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、1.0 ml、2.0 ml，加 1%冰醋酸定容，摇匀，得系列混合对照品溶液。按“1.2”项下色谱条件进样分析，以各组分的浓度x为横坐标，相应峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程及r，同时计算5种有效组分的检测限和定量限，结果见表1。

表1 回归方程、检测限和定量限

2.3 精密度、稳定性和重复性试验

精密吸取“1.3”项下的混合对照品溶液，按“1.2”项下色谱条件连续进样6次，计算得维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B6和泛酸钙峰面积的RSD分别为0.56%、0.73%、0.48%、0.96%和0.87%，表明方法精密度良好。

精密吸取同一供试品溶液，分别于 0、2、4、8、10 h，按“1.2”项下色谱条件进样，测定峰面积，结果维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B6和泛酸钙峰面积的RSD分别为0.74%、1.08%、0.95%、1.25%和0.96%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

取同一批次复合维生素B片（批号：140605），按“1.3”项下方法制备供试品溶液，共6份，分别进样测定，结果维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B6和泛酸钙含量的RSD分别为0.57%、0.70%、0.82%、1.16%和0.61%，色谱峰相对保留时间的RSD分别为1.08%、0.93%、0.96%、0.85%和0.47%，表明方法重复性良好。

2.4 加样回收率试验

取已知各组分含量（维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B6和泛酸钙含量分别为 3.11、1.54、10.17、0.21 和 1.04 mg/片，平均片重：0.0743 g）的复合维生素B片20片，研细，精密称取0.07 g，共18份，分别置50 ml量瓶中，依次加入“1.3”项下对照品储备液（1）、（2）0.6、1.2、2.0 ml各 6 份，按“1.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样分析，计算回收率。结果见表2，RSD<2.7%，加样回收率均满足要求。

表2 加样回收率测定结果（%）

2.5 样品含量的测定

按“1.3”项下方法制备8个批次样品的供试品溶液，按“1.2”项下色谱条件进行测定，分别计算5种组分的含量，同时与《卫生部颁药品标准》化学药品及制剂第一册WS1-73(B)-89收载方法比较，检测结果基本相符，相对偏差在1.0%范围内，说明该方法能够满足复合维生素B中有效组分含量测定的要求，结果见表3。

表3 含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

采用岛津SPD-M20A二极管阵列检测器（PDA），按本文色谱条件对混合标准溶液进行200～600 nm全波长扫描，提取5种物质的紫外吸收图谱。可知维生素B1在248、254 nm处有较强的吸收峰；维生素B2在254、267、270 nm处有较强的吸收峰；烟酰胺在254 nm处有最大吸收峰，维生素B6在210、280 nm处有较强的吸收峰，泛酸钙在210 nm处有最大吸收峰；为兼顾多种组分同时检测，并综合考虑灵敏度、分离度等因素，分别考察各波长处的色谱图，发现维生素B1、维生素B2和烟酰胺在265 nm处，维生素B6和泛酸钙在210 nm峰形好，分离度满足要求，各组分在相应保留时间处有较强吸收，色谱图见图1。所以，本试验采用了不同波长检测，维生素B1、维生素B2和烟酰胺的检测波长为265 nm及维生素B6和泛酸钙的检测波长为210 nm。

3.2 流动相的选择

试验过程中分别考察了乙腈水、甲醇水、甲醇1%冰醋酸及缓冲盐、乙腈0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液、乙腈缓冲液（己烷磺酸钠和庚烷磺酸钠混合溶液）等流动相体系，结果显示，以乙腈缓冲液（己烷磺酸钠和庚烷磺酸钠混合溶液）为流动相时的总体分离效果较好，但个别组分色谱分离度欠佳；在此基础上调整了流动相的比例、己烷磺酸钠和庚烷磺酸钠的浓度，以及缓冲液的pH值，最终选定以乙腈缓冲液（6 mmol/L己烷磺酸钠，1 mmol/L庚烷磺酸钠混合溶液，用冰醋酸调节pH值至4.5）（20:80）为流动相，等度洗脱，各色谱峰的对称性良好、分离度满足要求。