UPLC-MS/MS检测血液中的东莨菪碱和右美托咪定

2018-08-28王瑞花栾玉静杜鸿雁王爱华

刑事技术 2018年4期

王瑞花，栾玉静，董颖，杜鸿雁，王爱华

（公安部物证鉴定中心，北京 100038）

东莨菪碱（Scopolamine）是一种莨菪烷型生物碱[1]，存在于茄科植物中，可用于麻醉镇痛、止咳、平喘，对动晕症有效，具有镇静、致幻作用[2-3]。右美托咪定作为一种新型的高选择性α2肾上腺素能受体激动剂[4-5]，拥有镇静、镇痛、抗焦虑、抗交感及呼吸抑制轻等特点[6]，镇静效应呈自然睡眠样[7]，是一种随时可唤醒的镇静剂[8]，广泛用于临床麻醉。近年来用二者混合物实施麻醉抢劫、强奸、杀人的案件不断增多。究其原因，笔者认为右美托咪定可使人失去意识，中枢性差，东莨菪碱可以起到中枢镇静作用，二者合用具有很好的协同作用，更主要的是二者不被管制，容易获得，且无色无味，放在饮料里很难被察觉。现有的检验方法仅限于单一药物的检验，主要有高效液相色谱方法[9-11]、高效液相色谱-串联质谱法[12-16]、毛细管电泳法[17]等。因而，本文旨在建立一种同时检测全血中东莨菪碱和右美托咪定的超高效液相色谱-串联质谱方法，以满足刑事案件的检验需求。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

ACQUITY UPLCXevo TQ MS系统， Masslynx工作站( 美国Waters 公司) ，Milli-Q 纯水系统( 美国Millipore 公司 )， BP210s 电子天平 (德国 Sartorius公司) ，东莨菪碱标准品（中国药品生物制品鉴定所，纯度大于99.0%），右美托咪定标准品（美国DrEhrebstorfer，99.0%），乙腈、甲酸铵为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

1.2 标准溶液的配制

精确称取右美托咪定、东莨菪碱标准品各10.0 mg，分别定容于10 mL的甲醇中，配置成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，在4 ℃冰箱中保存，实验过程中根据需要，用乙腈逐级稀释。

1.3 样品的制备

取血液样品1.0 mL，用4 mL 0.1 moL/L的盐酸进行稀释，振荡、离心（8000 r/min，20 min），上清液经3 mL甲醇活化，3 mL水、0.1 moL/L的盐酸润洗过的Oasis MCX固相萃取柱，经3 mL 0.1 moL/L的盐酸、3 mL甲醇淋洗，弃去淋洗液，离心甩干萃取柱，3 mL 2%氨水甲醇洗脱，收集洗脱液，50 ℃空气流下挥干，500 μL初始流动相定容，过0.22 μm有机相微孔滤膜，供LC-MS/MS分析。

1.4 色谱质谱条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱( 100 mm×2. 1 mm，1.7 μm) ，柱温35 ℃。流动相A：乙腈；流动相B： pH 9水溶液；洗脱方式：梯度洗脱，详见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件Table 1 Gradient of mobile phase

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子源( ESI) ，正离子模式，多反应监测模式( MRM)，毛细管电压1.0 kV，去溶剂温度450 ℃，去溶剂气流速1000 L/h。两种物质的质谱参数见表2。

表2 东莨菪碱和右美托咪定的检测参数Table 2 Mass spectrum parameters of scopolamine and dexmedetomidine

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的选择

根据东莨菪碱和右美托咪定的结构特点，选择电喷雾正离子电离模式，取200 ng/mL东莨菪碱、右美托咪定标准溶液，以20 µL/min的速度直接进样，分别对喷雾电压、毛细管温度、雾化流速及温度等参数进行优化，通过全扫描方式观察，得到目标化合物的准分子离子。通过碰撞反应进行离子扫描，选择丰度较大的两个子离子作为定量离子和辅助定性离子，目标物的质谱条件见表2。

实验考察了在ACQUITY UPLC®HSS T3 、ACQUITY UPLC BEH C18两种不同柱子和酸性（pH=3）碱性（pH=9）条件下不同流动相对二者的分离效果。结果表明此两款柱子均可达到对二者的分离，但在酸性条件下，东菪莨碱因溶剂效应的影响，存在前拖尾现象，在ACQUITY UPLC BEH C18柱上碱性条件下分离，其效果好，灵敏度高、峰形对称，分析结果见图 1～3。

在选定的实验条件下，分析空白血样，不受血液中基质的干扰（见图4），东莨菪碱和右美托咪定具有良好的色谱峰，保留时间分别为1.46 min 和1.89 min（见图5）。表明本方法具有良好的专属性。

图1 BEH C18柱总离子流图 ( pH=3)Fig.1 TIC chromatogram of BEH C18 (pH=3)

图2 HSS T3柱总离子流图( pH=3)Fig.2 TIC chromatogram of HSS T3 (pH=3)

图3 BEH C18柱总离子流图(pH=9)Fig.3 TIC chromatogram of BEH C18 (pH=9)

图4 空白血MRM色谱图Fig.4 MRM chromatogram of blank blood

图5 空白血添加50ng标准物质的MRM色谱图Fig.5 MRM chromatogram of 50ng standard substance in blank blood

2.2 前处理方法的选择

实验比较了液液萃取、乙腈沉淀蛋白和固相萃取3种方法对两种化合物的提取效果，表明东莨菪碱液液萃取提取回收率低，乙腈沉淀蛋白法简单快速，但二者之间的回收率差异较大。针对固相萃取实验比较了OasisÒ HLB与OasisÒMCX两种小柱，相关数据见表3，本实验最终选用萃取物干净、萃取效果好的OasisÒMCX柱进行实验。

表3 乙腈沉淀蛋白、液液提取和固相萃取的平均回收率Table 3 Average recovery rate of acetonitrile-precipitated protein, liquid-liquid extraction and solid phase extraction

2.3 基质效应的影响

毒物分析中最常用的基质效应评价方法是提取后加入法。本实验测定标准品溶液的色谱峰面积(S1) 和空白样品基质提取液添加标准溶液后的色谱峰面积(S2) ，以比值S2 /S1(%)来评价基质效应。实验对四种提取方法的基质效应做了比较，结果显示OasisÒMCX萃取的基质效应不明显，血液中两种药物在10、50、100 ng /L 浓度时的基质效应值均在87.1%～107.6%之间。

2.4 线性范围和检出限

血样1.0 mL若干份，分别加入适量的东莨菪碱和右美托咪定标准工作液，使二者在血液样品中的浓度分别为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL，按照1.3的方法进行提取，1.4的方法进行分析，以浓度对定量离子的峰面积进行线性回归，得右美托咪定和东莨菪碱的回归方程分别为：y= 710.33x+1652.4和y= 444.16x- 1087；二者均在1.0～200.0 ng/mL 线性范围内关系良好，相关系数分别为R2=0.9991和R2=0.9962。按信噪比（S/N）≥3，计算得血液中二者的检出限均低于0.1 ng/mL。