硬质渗透性载体表面接触DNA的检验

严安心，王 冲，凃 政，徐秀兰，徐 珍，陈 静，李永久

（公安部物证鉴定中心，北京100038）

接触DNA也称为脱落细胞DNA，是指通过人体皮肤接触而遗留在载体表面上的DNA。Wickenheiser[1]的研究表明，每人每天大约会自然脱落400 000个上皮细胞，这成为接触DNA的主要来源。根据物质交换原理，任何进入犯罪现场的个体只要与现场实物发生接触，都会留下接触痕迹，这成为DNA的检验基础。随着DNA检验灵敏度的不断提高，大量可能载有接触DNA的检材越来越受到办案人员的重视[2]。载体属性、提取部位、检验策略等多种因素都会影响接触DNA的检出率[3]。在众多种类的检材中，石头、混凝土块等检材由于受其质地坚硬、表面积大、表面粗糙、具渗透性、表面附着物多、组成成分中含PCR抑制物多等因素影响，通常不利于脱落细胞的发现和提取，是法医接触DNA检验的一大难点。本文通过对一起杀人案中石头、混凝土块上嫌疑人DNA的成功检验，探索了硬质渗透性载体上接触DNA的检验方法。

1 案例资料

1.1 简要案情

某市发生一起命案，某人被多人殴打，致重度颅脑损伤而死。现场发现的石头、混凝土块被推断系致死工具。有关单位将石头、混凝土块等检材送检，要求进行DNA检验。

1.2 案件检验

1.2.1 荧光检测

荧光显现剂由苏州晓松科技开发有限公司提供，含有茚二酮、乙酸乙酯、甘油、乙醇、石油醚等成分，工作液按试剂说明现配现用。

荧光显现：首先使用荧光显现剂对送检石头、混凝土块表面进行整体喷涂，不留死角，然后在相对湿度小于40%，常温环境中放置1 h，晾干（也可在80～85 ℃的环境下干燥15 min），使用激光物证勘查仪（苏州晓松科技开发有限公司提供），选择发射波长为 532 nm、光谱半高宽度小于1 nm的激光（绿光）对充分反应后的石头和混凝土块照射，保持距离在30 cm以上且控制载体表面形成50万lx的照度，使用只允许540 nm及以上光波通过的滤光镜（其它光波不能通过）观察石头和混凝土块表面荧光显现情况。

1.2.2 脱落细胞的收集和DNA 提取

上述1.2.1中出现荧光反应的位置，应为可能存在脱落细胞的部位，使用生物脱落细胞提取仪（公安部物证鉴定中心研制）进行定点吸附，时间约为20～30 s（每个部位均单独进行吸附提取），取出滤膜，剪碎，置入1.5 mL管中，加入200 μL裂解液（QIAGEN M48 DNA提取试剂盒组分）和20 μL蛋白酶K（5 mg/mL），震荡后置于56 ℃保温2 h，离心，取上清。上清液采用QIAGEN M48 DNA提取试剂盒进行浓缩纯化。

1.2.3 STR分型检验

采用GlobalFilerTMPCR复合扩增试剂盒扩增，产物经3500xL遗传分析仪检测，以GeneMapper®ID-X 1.4软件进行STR分型。操作按试剂、仪器说明书进行。

1.3 检验结果

经荧光检测，观察到在石头上有2处疑似接触痕迹，在混凝土块上有3处疑似接触痕迹（部分痕迹的显现情况见图1）。对此5处疑似接触部位分别进行DNA提取检验。结果石头表面获得的DNA分型（图2上）与犯罪嫌疑人任某的一致；混凝土块表面获得的DNA分型（图2下）与犯罪嫌疑人张某某的一致。

图1 表面接触痕迹的显现（箭头所指为疑似接触痕迹。a图载体为石头; b图载体为混凝土块）Fig.1 Exposal of the contact marks (indicated by the arrow)carrying human cells: (A) on the stone, (B) on the concrete block

图2 石头表面获得的DNA分型（上）和混凝土块表面获得的DNA分型（下）Fig.2 STR profiling of touch DNA from the surface of stone(upper) or concrete block (bottom)

2 讨论

人表皮脱落细胞，虽然多为角质上皮细胞，且细胞核多已退化，但在出汗较多、皮肤与物品紧密摩擦的情况下，仍会存留一定量的有核上皮细胞，这些细胞是接触DNA的主要来源，可以进行DNA检验。本文案例，由关键物证疑似致伤工具（石头、混凝土块）上获得嫌疑人的DNA分型是该案DNA鉴定的重点和难点。如果采用整体擦拭或整体吸附的方法提取检材表面的脱落细胞，会有以下问题：1）物体表面附着的PCR抑制成分将过多地被提取，影响后续的扩增反应；2）本案死者系颅脑损伤，有少量出血，整体提取可能会造成嫌疑人的脱落细胞被受害人的血迹掩盖或污染，从而影响结果解读；3）接触部位只占物体表面的一小部分，整体提取由于不能准确定位，带有一定的盲目性，有可能会造成接触部位的漏提或提取不充分，导致获得的细胞量不能满足DNA的检验需要。解决上述问题的最佳方案是先定位石头、混凝土块上的接触部位，再进行定点提取，从而在降低干扰物影响的同时提高获得单一个体DNA分型的可能性。

采用茚二酮荧光显现剂结合激光勘查技术对石头、混凝土块表面接触痕迹进行检测，使抽象的触摸部位具象化，而能实现肉眼观察。原理在于茚二酮能够与人体汗液中的氨基酸发生颜色反应，在532 nm激光（绿光）照射下会产生高强度的荧光。有研究表明，茚二酮显现潜在接触痕迹的灵敏度比DFO（1,8-二氮-9-芴酮）及茚三酮高；荧光效果也强；且在背景复杂时，可以更好地除去背景的干扰[4]。对于渗透性载体，茚二酮溶液不仅与载体表面的汗液成分反应，还能够与渗透至内部的汗液成分反应，增加了反应产物，进而增强了荧光效果。荧光物质本身具有特定的吸收光谱，当激发光的光谱与荧光物质的吸收光谱相耦合时，荧光物质分子吸收光能处于激发态；因激发态不稳定，将迅速回复到基态，从而释放能量产生荧光。茚二酮与氨基酸反应产物的吸收光谱与绿光光谱相匹配，在532 nm绿光照射下能够产生荧光。激光具有方向性好、单色性强、能量高度集中的特点[5]，是激发荧光物质发光的理想光源。在波长一定时，激光的照度越高，则单位面积上的光通量越大，相同光照面积下所产生的激发态荧光物质分子就越多，所激发的荧光也就越强，检测的灵敏度相应也就越高。本案例中激光物证勘查仪输出的532 nm激光（绿光）能够在载体表面形成50万lx的照度，笔者使用该强度激光成功观察到接触痕迹的荧光，而使用多波段光源中的绿光（光谱纯度和光照强度都相对较低）进行观察却并未发现明显的荧光。本案例接触DNA的分型结果清晰准确，各基因座等位基因间峰高均衡，无等位基因缺失和非特异性扩增等情况，说明茚二酮荧光显现剂和激光勘查技术的应用未对DNA的提取和扩增产生不利影响。

针对石头、混凝土块等硬质渗透性载体上脱落细胞的收集，可以采用棉签擦拭、负压吸附和直接刮取等方法，比较这三种方法，负压吸附法的收集效果更好。一方面，在相同的载体表面积下，负压吸附比棉签擦拭收集到的细胞数量多。再者渗透性载体由于内部疏松多空，脱落细胞容易伴随汗液等渗透其中，棉签擦拭只能收集表层的细胞，负压吸附则不仅能收集表层的细胞，还能收集距表层较近的渗透细胞。另一方面，负压吸附比直接刮取操作简单，杂质也相对较少。石头、混凝土块的表面较为坚硬，直接刮取操作也会较为困难；而刮取下来的粉末成分复杂，PCR抑制物较多，又不利于后续的扩增实验。

本文使用茚二酮荧光显现剂结合激光勘查技术成功定位石头、混凝土块表面上触摸痕迹，采用负压吸附方法收集微量的脱落细胞，通过该“定位-定点吸附-STR分析”的技术路线，分别获得了单一个体的DNA分型，本案的成功检验对此类硬质渗透性载体上接触DNA的检验具有一定的借鉴意义。