油桐花水提取物干预烧伤大鼠Bcl-2、Bax表达的研究

贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002

中医认为烧烫伤属于“烫火伤”范畴，常因外袭火毒，灼溃皮肤，皮肉焦卷，疼痛难忍甚至伤筋动骨，有些患者因火毒内攻，出现较重的全身症状[1]。油桐花具有消肿、镇痛、止血、生肌、促进伤口愈合等作用[2]，在烧烫伤治疗方面，有很好的疗效[3-4]。作为凋亡家族中最主要成员，Bcl-2与Bax在烧伤中也有重要作用[5-6]。但目前未见桐子花水提物调节Bcl-2与Bax表达干预烧烫伤相关文献报道。实验拟通过油桐花水提液调节凋亡蛋白Bcl-2、Bax干预烧烫伤，初步确定油桐花对烧烫伤的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级Wistar雄性大鼠60只，体重(150±20)g，适应性喂养一周，购于长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证编号：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 药品与试剂 油桐花采自贵州省遵义市正安县并由贵阳中医学院孙庆文教授鉴定，无水乙醇(批号：20150601，重庆川东化工集团有限公司)，二甲苯(批号：20150508，重庆茂业化学试剂有限公司)，烧烫伤膏(批号：20150601，长春海外制药集团有限公司)，苏木素染色液(批号：AR1180-1，博士德生物有限公司)，伊红染色液(批号：AR1180-2，博士德生物有限公司)，Elisa检测试剂盒(批号：CK-E30187R，上海研辉生物科技有限公司)。

1.3 主要仪器 FW177中草药粉粹机(天津市泰斯特仪器有限公司)，DZKW-4水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)，FA2204N电子天平(上海箐海仪器有限公司)，BCD-219冰箱(上海上菱白富乐)，RE-5210旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，KD-BM组织包埋机(浙江金华科迪)，XSZ-HS3生物显微镜(重庆光学仪器厂)，YD-335石蜡切片机(浙江金华益迪医疗设备厂)。

2 方法

2.1 药材处理 将采摘的新鲜油桐花晒干，再用粉碎机将其粉碎，装在塑料袋中封存，备用。

2.2 油桐花水提物制备 精取油桐花粉末25 g，装入盛有250 mL蒸馏水的圆底烧瓶，浸泡30 min，酒精灯加热回流2 h，纱布过滤3次，合并3次滤液，并将纱布中残留的液体压出。将滤液倒入蒸发皿中，水浴锅加热浓缩。按照上述步骤依次提取浓缩制得不同浓度(0.1g·mL-1、0.3 g·mL-1、0.6 g·mL-1)油桐花水提物，即高、中、低剂量组。

2.3 分组及造模 实验大鼠适应喂养一周，随机分为6组，分别为正常组、模型组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组10只。按照“从左到右，从上到下”标记，用剪刀剪去长毛后，20%硫化钠脱毛。脱毛24 h后称重，腹腔注射10%水合氯醛，待其充分麻醉后，使用台式超级控温烫伤仪对大鼠进行烫伤，设置温度为120℃，探头实际温度为90℃，烫伤时间为18 s。烫伤后用纱布覆盖或升高室内温度以保持大鼠体温恒定，防止大鼠麻醉烫伤后体温过低而死亡。烫伤3 d后，剪取正常组和造模组背部烧伤皮肤组织，放入4%多聚甲醛溶液固定，做HE染色，观察模型是否成功，造模成功病理切片显示炎性浸润严重。如图1所示。

2.4 给药 用棉签蘸取相应药物对各组烧伤大鼠创面进行均匀涂抹(模型组除外，高、中、低剂量组每次均涂抹1 mL左右，其中阳性对照组为市面上销售的烧烫伤膏)，每日1次，连续3周[7-9]。阳性对照组给药剂量约为0.13 g·kg-1，高剂量用0.6 g·mL-1油桐花水提液，中剂量用0.3 g·mL-1油桐花水提液，低剂量用0.1 g·mL-1油桐花水提液。

2.5 标本采集处理 于用药3周对各组大鼠背部进行图片给采集。大鼠断头取血，收集血液，离心机3 000 rpm离心10 min，取血清，标记好-80℃保存。剪取各组大鼠背部烧伤皮肤组织，放入4%多聚甲醛溶液固定，备用。

2.6 Elisa试剂盒检测 取出板条，室温均衡20 min。标准品孔与样本孔加样。加入辣根过氧化物酶100 μL。封闭反应孔，37℃水浴锅60 min。弃液体，滤纸拍干。洗涤液洗涤5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min。加终止液50 μL，450 nm波长测定各孔吸光度值。计算样品实际浓度。

2.7 HE染色和免疫组化 4%多聚甲醛固定24 h后按常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，然后使用自动包埋机把组织包埋成蜡块。切片后常规二甲苯脱蜡，经各级浓度乙醇脱水，然后进行苏木素-伊红HE染色或者用柠檬酸盐缓冲液加入微波炉进行抗原修复，PBS洗3次，每次2 min。滴加封闭液，37℃恒温箱30 min。弃多余液体，不洗。滴加适当稀释的兔1 gG(一抗)4℃过夜。PBS洗3次，每次2 min。滴加二抗，37℃恒温箱30 min。PBS洗3次，每次2 min。DAB显色，镜下观察，适时终止。自来水充分冲洗返蓝5 min。苏木素轻度复染，室温30 s。自来水冲洗2 min，80%，95%，100% ，100% Ⅱ的乙醇脱水各1 min；二甲苯 Ⅰ 2 min，二甲苯 Ⅱ 2 min透明。中性树脂封片，检视。

3 结果

3.1 大鼠烧烫伤创面恢复结果 不同剂量组油桐花水提物对大鼠烧伤创面恢复有明显效果，与模型组比较伤口直径明显减小。如图2所示。

3.2 Elisa检测 烧伤大鼠血清中Bcl-2、Bax表达情况见表1，与正常组比较，模型组血清中Bcl-2表达显著降低(P<0.01)，中剂量组、低剂量组血清中Bcl-2表达显著升高(P<0.01)，高剂量组与阳性对照组血清中Bcl-2表达无差异。与模型组比较，不同油桐花水提物剂量组及阳性对照组大鼠血清中Bcl-2表达水平显著上调(P<0.01)。

组别N剂量/g·kg-1Bcl-2/pg·mL-1正常组10-83.3±6.27*模型组10-64.9±9.10#阳性对照组100.1377.1±1.26*高剂量组102.0085.3±5.00*中剂量组101.00 162±23.0*#低剂量组100.33 118±8.77*#

注：与模型组比较，*P<0.01；与正常组比较，#P<0.01。

3.3 HE染色 模型组与正常组比较有大量纤维组织增生及炎性细胞浸润，皮下组织变性、坏死，模型制备成功。中剂量组和低剂量组基本无炎性细胞浸润，高剂量组和阳性对照组细胞轻度浸润。如图3所示。

3.4 免疫组化 与正常组比较，模型组促凋亡因子Bax表达水平显著升高。与模型组比较，油桐花水提物高、中、低剂量组促凋亡因子Bax表达水平下调。与模型组比较，油桐花水提物高、中、低剂量组抑凋亡因子Bcl-2表达水平上调。如图4、5所示。

4 讨论

烧伤是日常较为常见的意外伤害，一般因火焰烧伤、热接触伤、热液烫伤、电烧伤等造成严重炎症反应和疼痛，给人们的日常生活带来严重危害。中医药在治疗烧烫伤方面具有历史悠久、经验丰富的优势[10-11]。Bcl-2家族是细胞凋亡研究的一大热点，在细胞凋亡调控中发挥了重要作用。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最主要的抑制凋亡和促进凋亡蛋白[12]。Bcl-2/Bax比率是启动细胞凋亡的“分子开关”，细胞凋亡程度常用Bcl-2/Bax比率表示[13]。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与Bcl-2形成同源二聚体时抑制细胞凋亡[14-15]。试验及临床中常通过调节这两种蛋白表达来达到治疗的目的。油桐花为油桐(Vernicia fordii)所结的花，油桐又名桐子，为大戟科油桐属落叶小乔木，主要分布于四川、贵州、云南等省区[2,16]。油桐性味涩、微寒、有毒，归肺、心经，具有清热解毒，生肌的功效，油桐全株皆可入药，在民间有将其用于促进伤口愈合、消肿、镇痛、止血、消毒、麻醉等作用，油桐全身都是宝[4,16]，其开发利用价值，还需人们不断研究。

造模3天HE染色结果证明显示烧烫伤炎性浸润严重，造模成功。用药干预后HE染色结果证明，模型组大鼠皮肤组织内有大量炎性细胞浸润，烧伤大鼠模型制备成功，且油桐花水提物高、中、低剂量组皮肤组织内炎性细胞浸润有不程度的缓解，对烧伤有一定疗效。免疫组化检测结果表明，烧伤大鼠模型组皮肤组织中Bax表达较高、Bcl-2表达较低，而油桐花干预组大鼠皮肤组织中Bax表达较低、Bcl-2表达较高。由此可推测出，油桐花水提物可通过上调烧伤皮肤组织抑凋亡因子Bcl-2表达及下调烧伤皮肤组织促凋亡因子Bax表达，从而抑制细胞凋亡发生，促进烧伤创面愈合。Elisa检测结果说明，与正常组比较，模型组血清中Bcl-2表达显著降低。与模型组比较，不同油桐花水提物剂量组及阳性对照组均能显著上调大鼠血清中Bcl-2表达水平，增强皮肤组织抑制细胞凋亡作用。同时，在Elisa检测过程中，中剂量组和低剂量组Bax表达不稳定，不做统计；但其余4组表达是稳定可用的，正常组为(5.18±0.20)pg·mL-1、模型组为(3.75±0.09)pg·mL-1、阳性对照组为(6.03±0.57)pg·mL-1、高剂量组为(4.67±0.41)pg·mL-1，与模型组比较，正常组、高剂量组、阳性对照组血清中Bax表达有差异。油桐花水提物可以抑制烧伤大鼠血清中细胞凋亡，从而调节外周血中细胞凋亡，从而缓解大鼠烧烫伤。说明Bax、Bcl-2对烧烫伤形成与发展具有重要作用，油桐花水提物可通过上调烧烫伤大鼠中抑凋亡蛋白Bcl-2，从而调节Bcl-2/Bax比率，平衡Bax、Bcl-2含量，缓解烧烫伤病情。同时为后续进一步研究油桐花不同溶剂提取物，如醇提，乙酸乙酯提取、氯仿提取等，筛选出最佳干预烧烫伤溶剂提取物奠定一定实验基础。

综上，油桐花水提物可抑制烧伤大鼠细胞凋亡，恢复创面烧烫伤，与阳性药物烧烫伤膏作用相似，大鼠皮肤烧烫伤会导致皮肤组织中细胞凋亡升高。油桐花水提物可以通过抑制细胞凋亡，从而促进创面愈合，缓解烧烫伤病情。