培养基质量控制试验适用性检查方法研究

宁航忠

【摘要】目的：通过培养基适用性检查实验，证明培养基质量是否符合要求，确保微生物检查结果的准确性和可靠性。方法：按照《中国药典》2015年版相关要求，采用6种试验菌株和对照培养基进行试验。结果：被检计数培养基上的菌落平均數与对照培养基上的菌落数平均数比值均在0.5～2范围内，控制菌检查培养基符合检出要求。结论：培养基适用性检查实验结果符合规定，培养基质量符合要求。

【关键词】 计数培养基 对照培养基 控制菌检查培养基

培养基质量是影响微生物检验结果的重要环节，微生物限度检查用培养基主要分为需氧菌、霉菌和酵母菌计数测定用培养基和控制菌检查用培养基，《中国药典》2015年版通则1105收载用于计数的培养基有：胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、R2A琼脂培养基，用于控制菌大肠埃希菌检查的培养基有：麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基。适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价判断检验用培养基是否符合检验要求。

1 仪器

超净台、生物安全柜、生化培养箱、立式灭菌器、恒温电热鼓风干燥箱、电子天平

2 培养基

（1）被检培养基由广东环凯生物科技有限公司提供

胰酪大豆胨琼脂培养基批号为3105545、沙氏葡萄糖琼脂培养基批号为3105440、R2A琼脂培养基批号为3105266、麦康凯琼脂培养基批号为3105291、麦康凯液体培养基批号为3105470

（2）对照培养基由中国食品药品检定研究所提供。

胰酪大豆胨琼脂对照培养基批号为135025-201603、沙氏葡萄糖琼脂对照培养基批号为135013-201502、R2A琼脂对照培养基批号为135027-201401、麦康凯琼脂对照培养基批号为135009-201503、麦康凯液体对照培养基批号为135030-201602

3 试验菌株

试验用菌株传代次数不超过5代，由广东环凯微生物科技有限公司提供冷冻干燥菌种，为0代。

金黄色葡萄球菌（CMCC（B）26003）实验室编号：JP-3-20161016-1、铜绿假单胞菌（CMCC（B）10104）实验室编号：TL-3-20161016-1、枯草芽孢杆菌（CMCC（B）63501）实验室编号：KC-3-20161016-1、大肠埃希菌（CMCC（B）44102）实验室编号：DC-3-20161016-1、白色念珠菌（CMCC（F）98001）实验室编号：BN-3-20161022-1、黑曲霉（CMCC（F）98003）实验室编号：HQ-3-20161028-1。

4 试验与结果

4.1 菌液制备

（1）接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。

（2）接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养48-72小时。用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。

（3）接种黑曲霉菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养5～7天，或直到获得丰富的孢子，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液制成制成适宜浓度的菌悬液，备用。

（4）、菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用，黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

4.2 菌液计数

（1）、取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌菌悬液各0.1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌株平行制备2个平皿，轻轻摇匀凝固后，30～35℃培养不超过3天，观察计数；

（2）、取白色念珠菌、黑曲霉菌的菌液各0.1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌株平行制备2个平皿，轻轻摇匀凝固后，20～25℃培养不超过5天，观察计数。菌悬液计数结果如下：

铜绿假单胞菌：10-656CFU/ml、枯草芽孢杆菌：10-758CFU/ml、金黄色葡萄球菌：10-662CFU/ml、大肠埃希菌：10-750CFU/ml、白色念珠菌：10-544CFU/ml、黑曲霉菌：10-540CFU/ml。

4.3 培养基配制方法

按培养基使用说明配制胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、R2A琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基（被捡培养基和对照培养基），经验证合格的灭菌程序进行灭菌后备用。

4.4 无菌性检查

取已灭菌的被捡培养基和对照培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基、R2A琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基各注2个平皿，于30℃～35℃培养3～5天；麦康凯液体培养基2瓶，于42℃～44℃培养不少于3天；沙氏葡萄糖琼脂培养基注2个平皿，20℃～25℃培养5～7天。各培养基均应无菌落生长。

经过规定时间培养，上述被捡培养基和对照培养基均为阴性。证明各培养基在规定时间内均无菌落生长，符合规定。可用于检查试验。

4.5 计数培养基的适用性检查

被检计数培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、R2A琼脂培养基。试验菌株：铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌，接种量不大于100CFU。实验操作如下：

（1）胰酪大豆胨琼脂对照培养基：取10个无菌平皿，分别接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌悬液各2皿，倾注胰酪大豆胨琼脂对照培养基，轻轻摇匀凝固后，于30～35℃培养，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌不超过3天，白色念珠菌、黑曲霉菌不超过5天，观察计数；

（2）沙氏葡萄糖琼脂对照培养基：取4个无菌平皿，分别接种取白色念珠菌、黑曲霉菌菌悬液各2皿，倾注沙氏葡萄糖琼脂对照培养基，轻轻摇匀凝固后，于20～25℃培养不超过5天，观察计数；

（3）R2A琼脂对照培养基：取6个无菌平皿，分别接种取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌悬液各2皿，倾注R2A琼脂对照培养基，轻轻摇匀凝固后，于30～35℃培养不超过3天，观察计数；

（4）各培养基取1个无菌培养皿不接种菌作为空白对照；

（5）被检培养基同法操作。

结果判断：被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。试验结果见下表。

计数培养基适用性检查试验结果

从上表检验结果可见，5种试验菌株的回收率均在50～200%范围内，并经观察鉴定菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，说明上述培养基的适用性检查符合规定。

4.6 控制菌检查培养基的适用性检查

被检培养基：麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基；试验菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌控制菌培养基适用性检查项目及所用菌株见下表。

4.6.1 麦康凯液体培养基适用性检查

a、促生长能力检查：取100ml麦康凯液体对照培养基3瓶，2瓶接种大肠埃希菌菌悬液，接种量不大于100cfu，摇匀，另一瓶不接种菌作为空白对照，于42～44℃培养箱培养24～48h；被捡培养基同法操作。观察培养基中试验菌株的生长情况。培养基中的试验菌应生长良好，空白对照应无菌生长。

检验结果：2瓶培养基内均出现浑浊，且浑浊相当，证明试验菌生长良好，空白对照为阴性，试验结果符合规定。

b、抑制能力检查：取100ml麦康凯液体对照培养基3瓶，2瓶接种金黄色葡萄球菌菌悬液，接种量大少于100cfu，摇匀，另一瓶不接种菌作为空白对照，于42～44℃培养箱培养24～48h；被捡培养基同法操作。培养基中试验菌株的生长情况。培养基中的试验菌应不得生长，空白对照应无菌生长。

检验结果：2瓶培养基均未出见浑浊，证明试验菌未生长，空白对照为阴性，试验结果符合规定。说明麦康凯液体培养基适用性检查符合规定。

4.6.2 麦康凯琼脂培养基适用性检查

促生长能力+指示特性检查：将灭菌后的麦康凯琼脂对照培养基，倾注平皿，30～35℃培养箱预培养后，备用，取3个无菌麦康凯琼脂对照培养基平板，2个平板用涂布法接种大肠埃希菌菌悬液，接种量不大于100cfu，另一平板不接種菌作为空白对照，涂布均匀后。于30～35℃培养箱培养18～24h；被捡培养基同法操作。观察培养基平板上试验菌的生长情况。培养基平板上菌落应生长良好，被检培养基菌落大小、形态特性、颜色、指示反应应与对照培养基上的菌落一致，空白对照平板应无菌落生长。

检验结果：被检培养基平板上菌落与对照培养基平板上菌落均生长良好，且菌落大小、形态特征、颜色及指示反应一致，空白对照平板无菌落生长，试验结果符合规定。说明麦康凯琼脂培养基适用性检查符合规定。

5 结论

5.1通过培养基适用性检查试验确定微生物实验室所用培养基、制备程序、保存条件等是否满足微生物限度检查用要求，只有当培养基满足培养基适用性的要求后，方可用于检验。根据适用性检查试验结果，上述培养基质量均符合规定，可用于微生物检查试验。

5.2培养基的质量控制试验若不符合规定，应寻找不合格的原因，以防此问题重复出现，任何不符合要求的培养基均不能使用。

【参考文献】

[1] 国家药典委员会，《中国药典》2015年

[2] 中国药品生物鉴定所，《中国药品检验标准操作规范》（2010年版）北京：中国医药科技出版社，2010

[3] 中国药典委员会，《中国药典分析检测技术指南》北京：中国医药科技出版社，2017.6