舒筋健脑颗粒对HIBD新生大鼠海马区BDNF及TrKB蛋白表达的影响*

2018-08-25宋名杨姜云飞朱路文吴孝军

中国中医急症 2018年8期

宋名杨姜云飞朱路文吴孝军叶涛唐强△

（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150001；2.黑龙江省哈尔滨市第二医院，黑龙江哈尔滨 150000；3.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040）

新生儿缺血缺氧性脑病（HIE）是新生儿在围生期因宫内或宫外缺氧所造成的脑部疾病，致死率较高，幸存者往往遗留智力、感官、运动等方面的神经功能损害，给个人、家庭、社会带来极大负担［1］，因此寻找有效治疗此病的手段尤为重要。目前我国治疗此病的传统医学方法多为针灸治疗，此法痛感明显，患儿常不配合，为治疗增加难度。舒筋健脑颗粒以水煎温服为治法，以补气活血为治则治疗缺血缺氧性脑病，其操作简单，易于家长及患儿接受，于临床中疗效显著［2］，且动物实验发现舒筋健脑颗粒可下调一氧化氮、一氧化氮合酶及肿瘤坏死因子的表达，从而减轻脑组织缺血缺氧性损伤［3］。脑源性神经营养因子（BDNF）与原癌基因TRK家族中的酪氨酸蛋白激酶B（TrKB）是一种渗透于神经系统各种活动的生物活性蛋白，具有促进进缺血缺氧脑损伤（HIBD）后脑组织的修复及再生的作用［4-6］。本研究观察新生大鼠脑缺血缺氧后及舒筋健脑颗粒干预后脑组织海马BDNF及TrKB的变化，探讨舒筋健脑颗粒治疗HIBD的相关作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物取48只平均体质量于13.2～15.4 g之间、雌雄不限的7日龄清洁级Sprague-Dawley大鼠）黑龙江中医药大学动物实验中心提供，许可证编号：SCXK （黑）2008001。采用随机数字表法分为4个组，即空白组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组，每组12只，并于造模后14、28 d时间点再分成两个亚组（n=6）。各组大鼠可自由食水，室温恒定于20～25℃，湿度保持50%～60%，明暗光照12 h昼夜循环，各组大鼠均于25日龄时与母鼠分离。

1.2 试药与仪器 1）试药。舒筋健脑颗粒，组成：川椒3 g，千年健 10 g，炙黄芪 20 g，炒赤芍 10 g，炒川芎 6 g，当归 10 g，广地龙 10 g，杜仲 10 g，石菖蒲 6 g，宣木瓜10 g，伸筋草15 g，鸡血藤15 g组成，均为饮片（天江制药公司），将饮片加入由0.9%氯化钠注射液制成的0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，温水浴加热约37℃，配制成混悬药液备用（中药低剂量组质量浓度：每毫升含生药1 g；中药高剂量组质量浓度：每毫升含生药4 g）。2）仪器。一抗：均为兔抗大鼠，BDNF（wanleibo，WL0168，1∶500）、TrKB（wanleibo，WL00554，1∶300）多克隆抗体。二抗：羊抗兔（北京中杉金桥）。蛋白酶抑制剂Cocktail：（Ce1lSignaling Tech-nology）；DK-8D 型 H 孔电热恒温水槽（上海一恒）；PL303型电子天平（上海梅特勒托利多）；双垂直蛋白电泳仪DYCZ-24DN（北京六一）；超速冷冻离心机H-2050R （长沙湘仪），8%O2+92%N2混合气体（哈尔滨黎明气体集团）。

1.3 模型制备参照Rice-Vannucci经典方法建立新生大鼠HIBD动物模型［7］。大鼠乙醚吸入麻醉，固定手术台，常规消毒后，左侧颈部纵行切开暴露左侧颈总动脉并分离，结扎两端，中间剪断，缝合皮肤，放入装有母鼠粪便的垫料中2 h，随后予以8%O2+92%N2混合气体缺氧处理2 h。缺氧结束后，大鼠出现自发或夹尾左旋者证明实验模型制作成功，回笼母乳喂养。空白组仅破皮暴露左侧颈总动脉，缝合回笼母乳饲养。

1.4 给药方法空白组：术后24 h予温0.9%氯化钠注射液灌胃（5 mL/kg），放置回笼，早晚各1次。模型组：术后24 h予温0.9%氯化钠注射液灌胃（5 mL/kg），放置回笼，早晚各1次。中药低剂量组：术后24 h予低剂量浓度舒筋健脑颗粒混悬液灌胃（5 mL/kg），放置回笼，早晚各1次。中药高剂量组：术后24h予高剂量浓度舒筋健脑颗粒混悬液灌胃（5 mL/kg），放置回笼，早晚各1次。

1.5 标本采集与检测 1）取材：各组大鼠在不同时间点（造模后14、28 d），腹腔注入10%水合氯酸深度麻醉，于低温环境下快速断头取脑，分离左侧海马组织［8］，0.9%氯化钠注射液冲洗表面，箔纸包裹，置于标本瓶中，液氮速冻后-80℃超低温冰箱冻存备用。2）蛋白免疫印迹试验（Western blotting）法检测各组大鼠海马BDNF、TrkB蛋白的表达。提取大鼠海马蛋白，用Nanodrop测定样品中蛋白浓度。根据BDNF和TrkB的分子量选择SDS-PAGE胶电泳分离蛋白质，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，将PVDF膜放入一抗封闭缓冲液中室温摇床震荡1 h，分别加入BDNF、TrkB、β-actin抗体盒中，4℃过夜。PBS缓冲液漂洗3次，将PVDF膜分别放入加有羊抗兔二抗的抗体盒中，37℃孵育45min，ECL显影。采集BDNF、TrkB及β-actin条带灰度值，得到各样本 BDNF、TrkB与β-actin的灰度比值。以空白组某一样本相对表达量为1，其余样本均较正后的相对表达量。

1.6 统计学处理应用SPSS16.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较选用单因素方差分析，两两间差异选用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠海马区BDNF的Western blotting检测结果见表1、图1。造模后14、28 d，模型组与空白组相比，大鼠海马区BDNF蛋白表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，中药低剂量组及中药高剂量组大鼠海马区BDNF蛋白表达均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），中药高剂量组BDNF蛋白表达较中药低剂量组高（P<0.05）。

表1 各组不同时间点大鼠海马区BDNF蛋白表达比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与空白组比较，△P＜0.05；与中药低剂量组比较，●P＜0.05。下同

组别 n 14 d 28 d空白组 6 0.2350±0.01871 0.2783±0.02563模型组 6 0.3233±0.02944△ 0.4417±0.02137△中药低剂量组 6 0.5333±0.02066*△ 0.6100±0.0200*△中药高剂量组 6 0.7400±0.02098*△● 0.8200±0.02828*△●

2.2 各组大鼠海马区TrkB的Western blotting检测结果见表2，图2。空白组大鼠仅有少量TrkB蛋白表达；造模后14、28 d，与空白组比较，模型组大鼠海马区TrkB蛋白表达增高（P<0.05）；与模型组比较，中药低剂量组及中药高剂量组大鼠海马区TrkB蛋白表达较明显（P<0.05），与中药低剂量组比较，中药高剂量组TrkB蛋白表达更明显（P<0.05）。

图1 各组14、28 d BDNF蛋白表达

表2 各组不同时间点大鼠海马区TrkB蛋白表达比较（±s）

组别 n 14 d 28 d空白组 6 0.2150±0.01871 0.2583±0.01602模型组 6 0.3717±0.02714△ 0.4250±0.01871△中药低剂量组 6 0.4533±0.018762*△ 0.5133±0.01506*△中药高剂量组 6 0.6717±0.02317*△● 0.7200±0.01789*△●

图2 各组14、28 d TrkB蛋白表达

3 讨论

舒筋健脑颗粒是根据清代医家王清任医方补阳还五汤加减得来，方中的赤芍、川芎配以当归活血化瘀，黄芪补气扶正，并予以地龙、伸筋草等通筋活络，将药力行至全身，最终达到气旺血行、瘀祛络通的效果［9-11］。此方对新生儿缺血缺氧性脑病标本兼治，达到促进缺血缺氧后脑组织修复的目的，并已应用于临床中，且疗效显著。

BDNF是一种可促进神经元发挥生理作用（生存、发育、分化、再生），维持神经细胞代谢功能，增强中枢神经的营养、支持、保护及功能表达的一种活性作用较强的神经营养因子［12］，在海马区含量较多。TrkB是BDNF所必需的中介体，其胞内含有酪氨酸蛋白激酶区（TK区），可以传递信号，反应性引起细胞内各信号通路活化，从而发挥BDNF的生物学效应。当HIBD发生后，BDNF、TrkB蛋白在受损区高度表达，二者大量结合提升TrkB自身磷酸化的作用，刺激并活化Ras-MAPK通路，进而于CAMP反应元件结合蛋白（CREB）的丝氨酸位点促使CREB活化，维持神经细胞存活并促进其修复，而BDNF还可诱导神经干细胞增殖、分化并迁移至受损区域替代受损的神经元，这些作用相辅相成，共同抵御脑组织的缺血缺氧性损伤，修复受损神经元，使神经系统在解剖及功能上得到最大限度的恢复［13-16］。本实验各时间点模型组BDNF、TrkB蛋白表达均较空白组增加，说明脑缺血缺氧可启动内源性保护机制促进BDNF、TrkB的表达，保护及修复受损的神经元；而各时间点中药低剂量组及中药高剂量组BDNF、TrkB的表达较模型组明显增加，说明舒筋健脑颗粒可以在缺血缺氧的条件下显著调控神经系统中BDNF、TrkB的表达；各时间点，中药高剂量组较中药低剂量组的BDNF、TrkB蛋白表达较多，说明应用高剂量的舒筋健颗粒在促进脑组织修复及再生上可发挥更大作用。

综上所述，舒筋健脑颗粒可延缓HIBD新生大鼠脑组织损伤并促进其修复，其机制可能与舒筋健脑颗粒上调BDNF、TrkB蛋白表达有关，且高剂量的舒筋健脑颗粒可促进BDNF、TrkB蛋白更为明显地表达，从而发挥对中枢神经系统的保护及修复作用。