科罗索酸增强右美托咪定对链尿佐菌素诱导的糖尿病大鼠心肌氧化应激和凋亡的保护作用①

姜 华 王维强 魏桂花

(成都市第三人民医院麻醉科，成都 610031)

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，是一种世界性的健康问题[1]。在我国，糖尿病在20岁以上的成年人中发病率可达9.7%，并且约有15.5%的人处于糖尿病发病前期[2]。心血管疾病是糖尿病最常见的并发症，也是导致糖尿病患者死亡的主要原因[3]。研究表明，糖尿病患者通常都伴有心脏收缩及舒张功能障碍、心肌肥大和纤维化，并易发展为冠心病和充血性心力衰竭，最终导致患者死亡[4]。糖尿病不仅能导致内皮功能紊乱和动脉粥样硬化，也能导致直接的心肌损伤[5]。研究表明，氧化应激在糖尿病诱导的心肌损伤的过程中起重要作用，活性氧的大量产生可直接导致大量心肌细胞凋亡，最终导致心力衰竭[6]。因此，有效抑制氧化应激和心肌细胞凋亡是缓解糖尿病心血管疾病的关键。目前对于心血管疾病的治疗主要是采用手术恢复冠脉血流，但糖尿病会增加术后患者复发及死亡的风险[7]。科罗索酸(Corosolic acid,CA)是从紫薇中提取的一类五环三萜化合物，具有肿瘤、抗炎、抗氧化及抗糖尿病活性，并且还能减轻糖尿病诱导的肺损伤[8]。右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)是临床常用麻醉药，具有镇静、镇痛及抗焦虑功效[9]。已有研究表明，DEX能减轻心肌缺血损伤，但尚不足以影响心肌缺血预后[10,11]。CA和DEX联合用药是否能增强DEX抗糖尿病诱导的心肌损伤还未见报道。本文采用链尿佐菌素 (Streptozotocin,STZ)复制大鼠糖尿病模型，探究CA对DTX缓解糖尿病心肌损伤的作用的影响。

1 材料与方法

1.1材料 CA购自上海纯优公司，分子式为C30H48O4，分子量为472.7，纯度≥98%，DEX购自江西恒瑞医药有限公司(批号：12071033)；STZ购自美国Sigma公司；高脂饲料购自武汉亚法生物技术公司(批号：040508)；肌红蛋白(Myoglobin,Mb)、肌酸激酶同工酶 (Creatine kinase MB,CK-MB)、心肌肌钙蛋白I (Cardiac troponin I,cTnI)购自上海纪宁生物科技公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD) 和丙二醛 (Malondialdehyde,MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor-α,TNF-α) 和白介素-6 (Interleukin-6,IL-6)以及Ki67和Caspase-3一抗，兔抗小鼠二抗均购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及模型复制 60只雄性SD大鼠购自成都达硕实验动物有限公司，体重220～300 g，生产许可证号：SCXK(川)2013-24。将大鼠随机分为对照(Control,Ctrl)组、STZ组、CA组、DEX组和CA+DEX组。将大鼠适应性喂养3 d后，除Ctrl外，其余组腹腔注射STZ(60 mg/kg)，Ctrl组则腹腔注射相同体积的生理盐水。注射STZ 7 d后取空腹血检测空腹血糖，空腹血糖>7.8 mmol/L的大鼠视为造模成功。自复制模型成功起，每天腹腔注射给予DEX (20 μg/kg)和CA (20 mg/kg)，连续7 d。

1.2.2组织及血液样品准备 给予CA和DEX 7 d后，给予大鼠过量的10%水合氯醛处死大鼠，并立即打开胸腔暴露心脏，用注射器于右心室抽取血液，取左心室并分为2份，一份用4%多聚甲醛固定后制作石蜡切片，另一份-80℃储存，用于Western blot实验。

1.2.3HE染色检测心肌组织病理损伤 取石蜡切片，用二甲苯脱蜡后，加入乙醇(浓度由高到低)进行处理。用蒸馏水冲洗5 min后，加入苏木精染色 5 min。用流水冲洗未结合的苏木精，用0.5%的盐酸酒精进行分色，水洗蓝化8 s后，用乙醇脱水。随后加入伊红染色液染色30 s，再次用乙醇脱水，最后用二甲苯透明，用树脂封片后于生物显微镜下观察心肌组织病变情况。

1.2.4试剂盒检测心功能及氧化应激相关指标 将大鼠血液于室温静置1 h后，4℃ 35 000 r/min离心15 min，去上层血清根据试剂盒说明书检测血清Mb、CK-MB、cTnI、SOD和MDA的浓度。

1.2.5Western blot检测细胞增殖及凋亡 用RIPA裂解液提取心肌组织总蛋白，并用BCA试剂盒检测蛋白浓度。10%SDS-PAGE分离各组蛋白质，用半干转膜仪将蛋白质转移到PVDF膜，用5%的牛血清白蛋白室温封闭蛋白质2 h，2 h后更换为适宜浓度的一抗，于4 ℃封闭过夜。第二天用缓冲液洗去未结合一抗，加入二抗室温孵育1 h后，滴加化学发光显色液，于暗室曝光显影。用Image J对蛋白质条带进行半定量分析，以GAPDH为内参。

1.2.6ELISA检测炎症因子的表达 取血清，根据ELISA试剂盒说明书检测血清TNF-α和IL-6的浓度。

2 结果

2.1CA对DEX缓解糖尿病大鼠心肌病理损伤作用的影响 如图1所示，Ctrl组大鼠心肌组织无明显病理变化。STZ组大鼠心肌细胞排列紊乱、断裂，细胞核出现固缩，有中到重度水肿及炎性细胞的浸润，表明造模成功；CA和DEX组心肌细胞紊乱、断裂程度与STZ组比较有所减轻，有轻度水肿及炎性细胞浸润，DEX组核固缩明显减少。CA+DEX组心肌细胞排列基本整齐，核固缩明显减少，基本无细胞断裂及水肿，表明CA能增强DEX缓解糖尿病大鼠心肌损伤的作用。

2.2CA对DEX增强糖尿病大鼠心脏功能作用的影响 与Ctrl组比较，STZ组大鼠血清Mb、CK-MB和cTnI的浓度显著升高，表明造模成功 (P<0.01，图2)；与STZ组比较，DEX组模型大鼠血清Mb、CK-MB和cTnI的浓度明显降低 (P<0.01，图2)，CA组大鼠血清cTnI的浓度也明显低于STZ组 (P<0.01，图2)；与DEX组比较，CA+DEX组模型大鼠血清Mb、CK-MB和cTnI的浓度进一步降低 (P<0.01，图2)，表明CA能增强DEX促进糖尿病大鼠心脏功能恢复的作用。

图1 CA对DEX缓解糖尿病大鼠心肌病理损伤作用的影响Fig.1 Effect of CA on DEX alleviating myocardial injury of diabetic ratsNote:n=8.Myocardial injury was visualized by HE staining.

图2 CA对DEX促进糖尿病大鼠血清Mb、CK-MB和cTnI分泌的影响Fig.2 Effects of CA on promotive effect on secretion of Mb,CK-MB and cTnI by DEXNote:The concentration of Mb,CK-MB and cTnI were detected by kits.Each experiment was repeated at least three times.n= 8,**.P<0.01 vs Ctrl group；##.P<0.01 vs STZ group；&&.P<0.01 vs DEX group.

2.3CA对DEX抗心肌氧化应激作用的影响 与Ctrl组比较，STZ组糖尿病大鼠血清SOD浓度明显降低(P<0.01，图3)，MDA浓度明显升高 (P<0.01，图3)；与STZ组比较，CA组和DEX组血清SOD浓度明显升高、MDA浓度明显降低(P<0.01，图3)；CA+DEX组大鼠血清SOD浓度与DEX组比较明显升高、MDA浓度明显降低(P<0.01，图3)，表明CA能增强DEX抗糖尿病大鼠心肌组织氧化应激的作用。

2.4CA对DEX抗心肌细胞凋亡作用的影响 Western blot实验结果表明，STZ组大鼠心肌组织Ki67的蛋白表达水平明显降低 (P<0.01，图4)，Caspase-3表达水平明显升高 (P<0.01，图4)，与Ctrl组比较差异具有统计学意义；CA和DEX能显著促进糖尿病大鼠心肌组织Ki67的表达，抑制Caspase-3表达 (P<0.01，图4)；CA+DEX组大鼠心肌组织Ki67表达水平与DEX组比较明显升高 (P<0.01，图4)，Caspase-3表达水平与DEX组比较显著降低 (P<0.01，图4)，表明CA能增强DEX对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用。

图3 CA对DEX抗氧化应激作用的影响Fig.3 Effect of CA on anti-oxidative stress of DEXNote:n= 8,**.P<0.01 vs Ctrl group;##.P<0.01 vs STZ group;&&.P<0.01 vs DEX group.

图4 CA对DEX抗心肌细胞凋亡作用的影响Fig.4 Effect of CA on anti-apoptosis effect of DEX in myocardiumNote:GAPDH was used as loading control,n=8,**.P<0.01 vs Ctrl group；##.P<0.01 vs STZ group；&&.P<0.01 vs DEX group.

图5 CA对DEX抗炎作用的影响Fig.5 Effect of CA on anti-inflamatory effect of DEXNote:n=8,**.P<0.01 vs Ctrl group；##.P<0.01 vs STZ group；&&.P<0.01 vs DEX group.

2.5CA对DEX抗炎作用的影响 ELISA实验结果表明，与Ctrl组比较，STZ组大鼠血清炎症因子TNF-α和IL-6的含量明显增多(P<0.01，图5)；与STZ组比较，CA组和DEX组糖尿病大鼠血清TNF-α和IL-6的分泌量显著减少 (P<0.01，图5)；与DEX组比较，CA+DEX组大鼠血清TNF-α和IL-6的浓度显著降低 (P<0.01，图5)，表明CA能增强DEX的抗炎作用。

3 讨论

大量研究表明，CA具有降血糖、抗糖尿病活性，被认为是最具抗糖尿病潜力的药物之一[12]。同时CA还能通过抑制心肌细胞凋亡和抗氧化应激对抗异丙肾上腺素诱导的心肌损伤[13]，但CA对糖尿病诱导的心肌损伤的作用还未见报道。本文研究采用高脂饲料联合STZ诱导糖尿病心肌损伤模型，并腹腔注射给予CA发现，CA能增强心肌功能、抑制心肌组织氧化应激和心肌细胞凋亡，从而减轻心肌组织损伤。DEX是临床常用麻醉药物，已有大量研究证明DEX有明确的心肌保护作用，能够通过抑制心肌细胞凋亡、氧化应激和炎症反应，对抗缺血再灌注引起的心肌组织损伤，也能减轻糖尿病诱导的心肌缺血损伤[10,14]。本文研究也发现，DEX能减轻STZ诱导的糖尿病大鼠心肌组织病理损伤，增强大鼠心功能，还能减轻心肌组织氧化应激、细胞凋亡及炎症反应。同时，CA还能显著增强DEX对心肌组织氧化应激、细胞凋亡和炎症反应的抑制作用，增强DEX促糖尿病大鼠心肌功能恢复的作用。

心血管疾病是糖尿病最常见的并发症之一，据统计，约有75%的糖尿病患者都有心血管疾病并发症[15]。虽然在糖尿病诱发心血管疾病早期没有明显的症状，但在发病早期进行干预有利于降低糖尿病心血管病的死亡率。研究表明，心脏功能的降低常伴有Mb、CK-MB和cTnI分泌的增多。本文研究也发现，STZ诱导的糖尿病大鼠血清Mb、CK-MB和cTnI的浓度明显升高，同时HE染色表明，STZ能明显造成大鼠心肌组织损伤，提示造模成功。研究表明，CA具有较强的降糖作用[12]。CA能显著增强DEX缓解糖尿病大鼠心肌组织病理损伤和抑制Mb、CK-MB和cTnI分泌的作用，表明CA能增强DEX的心肌保护作用。

研究表明，氧化应激是导致糖尿病心血管疾病心肌损伤的主要机制之一，过量活性氧的产生和抗氧化酶表达的减少是诱导氧化应激的主要原因[16]。活性氧可直接导致线粒体膜通透性增减，使分子量小于1.5 kD的物质进入线粒体，导致线粒体膜肿胀、能量供应障碍，直至线粒体膜被完全破坏，细胞色素C进入细胞质，启动细胞凋亡途径，导致心肌细胞凋亡，最终导致心力衰竭[17-19]。Yamaguchi等[20]研究发现CA能减轻代谢综合征大鼠的氧化应激反应。本文研究发现，CA能显著增加糖尿病大鼠血清抗氧化酶SOD的浓度，降低血清氧化产物MDA浓度，表明CA具有抗糖尿病大鼠氧化应激的作用。同时CA还能显著增强DEX对SOD表达的促进作用和对MDA分泌的抑制作用，表明CA能增强DEX抗糖尿病大鼠心肌组织氧化应激的作用。

心肌细胞凋亡是导致心脏功能衰竭的直接原因，抑制心肌细胞凋亡有利于减轻糖尿病诱导的心肌损伤[21,22]。Caspase家族是细胞凋亡的最终执行者。研究表明，Caspase-3在糖尿病诱导的心肌梗死模型大鼠心肌中表达明显增多，Caspase-3表达水平的上调能促进心血管疾病的发展[23]。在糖尿病诱导的心血管疾病早期，氧化应激可通过激活线粒体Caspase-3信号通路诱导心肌细胞凋亡[24]。本文研究表明，CA能显著抑制糖尿病大鼠心组织Caspase-3表达，并能促进细胞增殖标记蛋白Ki67表达，表明CA能抑制心肌细胞凋亡、促进心肌细胞增殖。此外，CA还能增强DEX抑制Caspase-3表达和促进Ki67表达的作用，表明CA能增强DEX抗心肌细胞凋亡的作用。

炎症反应是导致糖尿病大鼠心肌损伤的另一重要机制。研究表明，促炎因子的表达和心肌组织氧化应激呈正相关，炎症因子可通过减弱心肌细胞收缩能力和生存能力导致左心室功能的衰减[25,26]。白杨素可通过抑制TNF-α表达减轻心肌组织炎症反应，从而减轻糖尿病诱导的心肌损伤[27]。本文研究还发现，CA还能显著降低糖尿病模型大鼠血清炎症因子TNF-α和IL-6浓度，提示CA具有抗炎活性，与之前的报道一致[28]。同时，CA还能增强DEX抑制TNF-α和IL-6表达的作用，表明CA能增强DEX的抗炎活性，从而减轻糖尿病大鼠心肌损伤。

综上所述，CA和DEX均能增强STZ诱导的糖尿病大鼠心脏功能、减轻氧化应激、心肌细胞凋亡和炎症反应，从而减轻心肌损伤，CA还能增强DEX对糖尿病大鼠心脏功能、心肌组织氧化应激、细胞凋亡和炎症反应的调控作用，从而增强DEX对糖尿病大鼠的心肌保护作用。本文首次探究了CA对糖尿病诱导的心肌损伤的作用，并发现CA能增强DEX的心肌保护作用，为糖尿病诱导的心血管病的治疗提供了一种新的潜在联合用药方案。