碱解蒸馏法测定土壤水解性氮含量

林永锋，刘晓菲，李廷钊,2，董刚强*

(1.安利(中国)植物研发中心，江苏 无锡 214145； 2.安利(中国)研发中心，上海 201203)

土壤水解性氮，通常也称土壤有效氮，是铵态氮，硝态氮，氨基酸、酰胺和易水解的蛋白质氮的总和。作为一项主要的土壤氮素分析项目，与土壤全氮量相比，它更能反映土壤近期内的氮素供应状况和氮素释放速率，是反映土壤供氮能力的指标之一，与作物生长关系密切[1]。

目前，土壤水解性氮的测定方法主要有生物培养法[2-4]、酸水解法[5-6]、碱解扩散法和碱解蒸馏法等[7-9]。培养法过程复杂，在生产中难以应用。酸水解法适用于有机质含量较高的土壤，但在有机质缺乏的土壤上测定结果并不十分理想。林业行业标准中规定采用碱解扩散法。此法不但操作烦琐、检测时间长，而且因一些不可避免的设计缺陷，使得结果重现性差，甚至有时会发生错误。例如：碱解使用浓度较大的氢氧化钠与吸收液硼酸，二者同在一个容器(扩散皿)的内外室中，极易发生相互污染，导致结果偏高；玻璃板不能与扩散皿完全密封会导致氨气逸出，造成结果偏低。碱解蒸馏法能很好地避免这些问题，并能提高检验的准确性和速度。关于碱解蒸馏法测试土壤水解性氮含量已有部分报道，但由于实验仪器和环境条件存在差异，测定结果不尽相同[10-12]。本文在前人试验的基础上，利用FOSS Kjeltec 8400全自动定氮仪对碱解蒸馏法测试土壤水解性氮的条件进行了优化，在保证数据准确性和稳定性的基础上提高了测试效率，可为土壤分析工作提供参考。现总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验原理

将土壤样品置于自动定氮仪中，用一定浓度的氢氧化钠和锌-硫酸亚铁进行还原和水解，使硝态氮和其他易水解氮转化成铵态氮，经蒸馏后被定量吸收在硼酸溶液中，控制一定的时间或蒸馏体积，用标准酸进行滴定，计算水解性氮含量。

1.2 供试材料

购买国家有证标准土壤样品作为土壤有效态成分分析标准物质，包括ASA-8(新疆灰钙土)、ASA-9(陕西黄棉土)、ASA-10(安徽潮土)、ASA-1a(辽宁棕壤)。另采集不同区域土壤作为样本：S1，采自江苏无锡，水稻土，于2013年12月采集，当季种植菊花；S2，采自江苏无锡，水稻土，于2013年12月采集，当季种植菊花；S3，采自江苏无锡，水稻土，于2014年11月采集，当季种植豆科类等绿肥；S4，采自宁夏中宁，灰钙土，于2014年5月采集，当季种植枸杞；S5，采自甘肃岷县，黑土，于2014年9月采集，当季种植党参；S6，采自四川中江，紫色土，于2014年6月采集，当季种植丹参；S7，采自陕西洛川，黄棉土，于2013年12月采集，当季种植菊花。

1.3 仪器与试剂

1.3.1 仪器

Kjeltec 8400型全自动凯氏定氮仪，瑞典FOSS公司；T50 M自动电位滴定仪，梅特勒-托利多；Mettler XP204万分之一天平，梅特勒-托利多。其他仪器包括恒温箱，扩散皿(外室直径10 cm)，毛玻璃，5 mL半微量滴定管，250 mL消化管，小毛刷，橡皮筋。

1.3.2 试剂

所用试剂除另有说明外，分析时均使用符合国家标准的分析纯化学试剂和去离子水。

1.2、1.8、4、5、6、7、8 mol·L-1的NaOH溶液。分别称取48.0、72.0、160、200、240、280、320 g氢氧化钠溶解于水，定容至1 L。

10 g·L-1硼酸-指示剂混合液(全自动定氮仪使用)。称取50.0 g硼酸溶解于水中，定容至5 L。硼酸溶液中加入50 mL 0.1%溴甲酚绿和35 mL 0.1%甲基红，调节至红紫色。此液放置时间不宜过长，如在使用过程中pH值有变化，随时用稀酸或稀碱调节。

20 g·L-1硼酸-指示剂混合液(碱解扩散法使用)。称取20.0 g硼酸溶解于水中，定容至1 L。使用前每100 mL硼酸溶液中加入2 mL甲基红-溴甲酚绿混合指示剂(称取0.099 g溴甲酚绿和0.066 g甲基红于研钵中研细，溶解于100 mL乙醇中，该指示剂贮存期不超过2个月)，用稀盐酸或稀氢氧化钠溶液调节至红紫色。

1 mol·L-1HCl标准溶液(全自动定氮仪使用)。吸取9 mL浓HCl溶液于1 000 mL容量瓶中，用水稀释定容。采用自动滴定仪测定标准酸浓度。

0.01 mol·L-1的HCl标准溶液(碱解扩散法使用).将0.1 mol·L-1HCl标准溶液准确稀释10倍。

Zn-FeSO4·7H2O混合还原剂。50.0 g磨细并通过0.25 mm筛孔的硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和锌粉10.0 g 混匀，贮存在棕色瓶中。

碱性胶液。40 g阿拉伯胶和50 mL水于烧杯中，温热至70～80 ℃搅拌促溶，冷却约1 h，加入20 mL甘油和30 mL饱和K2CO3水溶液，搅匀放冷，离心除去泡沫及不溶物，将清液贮于玻璃瓶中备用。

液状石蜡。

200 mg·L-1(NH4)2SO4标准液。称取0.094 7 g 99.5%(NH4)2SO4定容于100 mL容量瓶中。

1.4 样品分析

碱解扩散法测试参照LY/T 1228—2015中的方法进行。

碱解蒸馏测试方法。准确称取3.000～5.000 g过60目的土壤样品于消化管内，加入锌-硫酸亚铁还原剂1.0 g、蒸馏水20 mL、液状石蜡1 mL，在FOSS Kjeltec 8400全自动定氮仪上加入NaOH溶液10 mL和浓度10 g·L-1硼酸-指示剂接收液30 mL，蒸馏终点体积150 mL。在滴定剂桶中加入已标定的0.1 mol·L-1盐酸溶液，进入样品分析栏开始对样品进行分析。每次分析前同时作空白试验。

根据下式计算土壤中碱解氮的含量(c，mg·kg-1)：

式中，cHCl为HCl标准液的浓度(mol·L-1)，V是样品测定时用去HCl标准液的体积(mL)，V0是空白测定时用去HCl标准液的体积(mL)，m是土壤烘干质量(g)。

2 结果与分析

2.1 NaOH浓度对土壤水解性氮含量测定的影响

当NaOH浓度过低时，易水解蛋白质水解不完全，导致检测结果偏低；当NaOH浓度过高时，某些难水解蛋白质发生部分水解，导致结果偏高[10-11]。因此，碱解蒸馏法中NaOH浓度的选择对测定结果至关重要。采用标准物质ASA-9(陕西黄棉土)、ASA-10(安徽潮土)对氢氧化钠溶液浓度的选择进行优化。由表1可知，随着氢氧化钠浓度升高，土壤碱解氮含量的测定结果逐渐升高。这与其他学者的研究结果一致[12-13]。从试验结果来看，当氢氧化钠浓度为6 mol·L-1时，检测结果与标准值具有很好的一致性，据此选择氢氧化钠浓度为6 mol·L-1。

表1 NaOH浓度对土壤水解性氮含量测定的影响

2.2 蒸馏功率对土壤水解性氮含量测定的影响

利用全自动定氮仪测定碱解氮时反应较剧烈，管内产生的大量气泡携带土壤粉末，容易造成管路堵塞，因此合适的碱解功率对试验结果至关重要。前期预试验表明，蒸馏功率越高，管内反应越剧烈，当仪器蒸馏功率达到80%及以上时，管内反应过于剧烈，容易造成管路堵塞；而当功率小于50%时，蒸馏时间过长，反应较缓慢，影响土壤的正常测试。由表2可知，当仪器功率为50%～70%时，土壤碱解氮含量在标准值范围(表1)之内，而且各功率测试值没有显著差异，相对标准偏差(RSD)均小于5%。试验过程观察发现，该功率下能有效防止溶液暴沸而阻塞管路。

表2 蒸馏功率对土壤水解性氮含量测定的影响

2.3 称样量对土壤水解性氮含量测定的影响

如表3所示，当称样量为3.0～5.0 g时，水解性氮含量测定结果基本一致，且RSD在0.1%～1.7%，因此建议样品称样量为3～5 g。

表3 称样量对土壤水解性氮含量测定的影响

2.4 方法检出限与测定下限

按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168—2010)的规定，滴定法的检出限可根据滴定管所产生最小液滴的体积计算得到。本方法中滴定管的最小液滴为0.002 4 mL，当取样量为3.000 0 g、标准盐酸浓度为0.1 mol·L-1时，经测算，方法检出限为1.12 mg·kg-1。以4倍的检出限作为测定下限，则该方法测试土壤水解性氮的测定下限为4.48 mg·kg-1。

2.5 方法准确度

根据上述对试验条件的优化，确定蒸馏法测试土壤水解性氮的参数：称取土样3～5 g，加1.0 g锌-七水硫酸亚铁混合催化剂、10 mL 6 mol·L-1NaOH溶液、20 mL H2O、1 mL液状石蜡，仪器蒸馏功率60%，1%硼酸接收液30 mL。

2.5.1 加标回收率

对3份土样进行硫酸铵加标回收试验，结果如表4所示，平均加标回收率为90.3%～109.7%，说明结果符合要求。

表4 碱解蒸馏法加标回收实验结果

2.5.2 标准样品测定

取土壤有效态成分分析标准物质ASA-8、ASA-9、ASA-10进行测试，每个样品平行测定6次，计算标准偏差和RSD(表5)。采用优化的试验条件对标准土壤样品进行测定的结果均合格，RSD为2.9%～3.9%。

表5 土壤标准样品水解性氮测试结果

2.5.3 日内和日间的重复性

取土壤有效态成分分析标准物质ASA-8、ASA-9、ASA-10作日内、日间重复性试验，日内每个样品平行测定6次，连续测试2 d，计算标准偏差和RSD(表6)。3个标准样品的测试值均在标准范围之内，且RSD为2.2%～4.5%，说明本方法重复性和稳定性较好。

2.5.4 精密度

对6个土壤样品分别平行测定6次，计算标准偏差和RSD(表7)，RSD均小于5%，说明本方法精密度较好。

表6 碱解蒸馏法重复性试验结果

表7 碱解蒸馏法精密度测试结果

2.5.5 不同测定方法的结果比较

分别采用碱解扩散法与碱解蒸馏法对10个土壤样品水解性氮含量进行测定，对2组数据作相关性分析和线性回归(图1)，结果显示，两者相关性在0.01水平显著，说明利用FOSS Kjeltec 8400全自动定氮仪测定土壤水解性氮是可行的。

图1 2种测试方法结果的相关性

3 讨论

研究显示，对于不同类型土壤，碱解蒸馏法和碱解扩散吸收法测定土壤中水解性氮含量具有相同的准确度[11,14-15]。但扩散吸收法操作烦琐，检测时间较长，测定样品需在40 ℃恒温烘箱内水解24 h。同时，由于不可避免的设计缺陷，在保温过程中容易造成扩散皿内、外室的液体混合，极易发生相互污染，特别是在使用较高的NaOH碱液水解样品时，易造成测定结果偏高，而如果涂抹阿拉伯胶后，毛玻璃板与扩散皿未完全密封，又会导致氨气逸出，造成测定结果偏低。另外，扩散法采用手工滴定，对操作者要求较高，一定程度上存在较大的误差。

碱解蒸馏法能很好地避免扩散法的上述问题。相比之下，凯氏定氮蒸馏法具有极为明显的优势：在操作方面，较大限度地降低了人为因素对测定结果的影响，而且快捷方便，测试分析时间大大缩短，滴定时由自动电位滴定仪完成，准确性和精密性更高，容器密闭性好，受污染可能小。

本文对蒸馏条件进行了控制和改进，在保证测定结果准确的同时，大大缩短了蒸馏时间(由24 h缩短到7 min之内)，简化操作，方法实用，可以作为一种测定土壤水解性氮的方法。操作要点如下：建议称样量3～5 g，碱的添加量以每次6 mol·L-1的NaOH溶液10 mL为宜，这样既能保证易水解蛋白质水解完全，又能控制难水解蛋白质进行水解，确保结果的准确性；蒸馏功率建议为50%～70%，并加入分析纯液状石蜡，可以防止发泡，避免管路阻塞，并能有效抑制杂质的产生。测试结果表明，碱解蒸馏法测定结果与标准值具有很好的一致性，加标回收率为90.3%～109.7%，日内重复性和日间重复性较好，说明该方法准确性和稳定性好，重现性佳，可满足规定精度的要求，更能满足大批量土样分析的需求。