2种生态型三叶青生长发育与总黄酮含量的比较

洪霞，赖小芳，邱莉萍，米敏，刘也楠，陈银龙

(台州市农业科学研究院，浙江 临海 317000)

三叶青为葡萄科崖爬藤属，又名金线吊葫芦、石猴子、石老鼠、蛇附子，块根或全草均可入药，具有消炎解毒、镇痛解热、抗癌、护肝等功效，有较高的药用价值[1-2]。临床上三叶青常用于治疗小儿高热、扁桃体炎、支气管炎、肺炎、肝炎、心脑血管疾病、肿瘤等[3-5]。野生三叶青分布广泛，主要有紫藤与青藤2个品种，生长区域界限明显，不混生[6]。由于野生资源多年来遭受采挖，导致日益稀少，在浙江省已被列入保护名录[7]。目前，多地已着手开展三叶青人工栽培与品种选育的研究，以满足日益增长的药材需求。本试验收集了野生紫藤三叶青的2个生态品种进行人工栽培，开展生长发育以及不同生长年限、不同部位总黄酮含量的研究，为三叶青优良品种选育以及收获年限提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2014年于浙江台州黄岩引入野生三叶青资源，分别为窄叶、阔叶2种生态型三叶青。窄叶三叶青与阔叶三叶青均为紫藤，叶片表面无毛。窄叶三叶青叶片狭长，深绿色，主叶脉正中对称；阔叶三叶青叶片较宽，浅绿色，主叶脉左右不对称。引入的野生阔叶三叶青块根用于总黄酮含量测定方法学考察。2种野生三叶青进行扦插育苗、移栽，连续3年收获不同生长年限的三叶青材料。

1.2 仪器与试剂

紫外分光光度计(UV-3100PC，Mapada)；超声波细胞粉碎机(JY 92-IIN，宁波新芝)；60目筛；电子天平(AL104)，梅特勒-托利多仪器；恒温干燥箱(上海博讯)。

芦丁标准品(中国药品生物制品检定所，批号10080-201409)；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇均为分析纯，国药集团化学制剂有限公司。

1.3 种植、收获与性状考察

2014年4月取三叶青茎段进行扦插，以金色3号为育苗基质，等成活出根，于当年7月取长势一致的幼苗进行移栽。采用控根容器栽培，直径30 cm，深度30 cm。以园土∶菌渣∶珍珠岩(5∶1∶1)，混合后作为栽培基质装填种植，每个控根容器均匀种植3株。阔叶三叶青与窄叶三叶青各种植25个控根容器，人工遮阴，统一管理。每年的7月中旬随机收获5个单株，对主蔓长度、分枝数、茎叶鲜重、T/R(地上部鲜重/块根总重)比值、单株块根数、单株块根总重(鲜重)这6个农艺性状进行了考察。考察后，将5个单株按照块根、藤茎、叶片分开并混合，放入恒温干燥箱105 ℃杀青20 min，50 ℃烘干至恒重备用。

1.4 总黄酮含量测定

1.4.1 供试品溶液制备

烘干后的三叶青样品用液氮磨成细粉后，过60目筛，精密称取0.15 g，加入5 mL 60%乙醇，超声破碎40 min，功率400 W，保护温度60 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，取上清。使用60%乙醇定容至5 mL。重复操作3次。

1.4.2 标准溶液配制

精密称取0.005 g芦丁标准品，加入25 mL 25%酒精超声溶解，配制成0.2 mg·mL-1标准溶液。

1.4.3 测试波长选择

取500 μL标准溶液与100 μL供试品溶液，分别加入100 μL 5%硝酸钠，混匀，静置5 min，加入100 μL 10%硝酸铝，混匀，静置5 min，加入1 mL 10% NaOH溶液混匀，最后加入60%乙醇适量，定容至2.5 mL，静置15 min，标准品反应液与供试品反应液均在200～800 nm进行吸光度扫描，总黄酮均在502 nm处有最大吸收波长。

1.4.4 标准曲线绘制

参照郑军献等[8]报道的方法进行优化测定。吸取标准溶液50、100、200、400、500、600、700、800、1 200 μL，按照1.4.3的反应方法，反应溶液在502 nm处测定吸光值。得标准曲线y=11.455x×0.009 5，r=0.997，芦丁在0.004～0.096 mg·mL-1浓度与吸光值之间有良好的线性关系。

1.4.5 方法学考察

精密度与稳定性。连续6次测定反应液的吸光值，计算得r值为0.57%，显示仪器的精密度良好。取测试波长的供试品反应液在10、20、40、60、80、90 min分别测定吸光值，得R值为1.96%，样品反应液在1.5 h内比较稳定。

方法重现性。平行操作6次，测定样品的黄酮含量。6次测定的黄酮含量分别为14.41、13.41、14.28、14.18、14.11、13.97 mg·g-1，均值14.06 mg·g-1，得r值为2.5%。

加样回收。精密称取已知含量为14.06 mg·g-1的样品0.15 g共6份，加入适量的芦丁对照品，按供试品溶液制备方法制备溶液，按1.4.3节操作，于502 nm波长处测定吸光度，计算得6次回收率分别为98.61%、96.83%、97.02%、95.13%、102.73%、99.43%，r值为2.67%。

1.5 数据分析

数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，显著性差异比较采用LSD法。

2 结果与分析

2.1 不同生长年限三叶青农艺性状的比较

由表1可知，2种生态型三叶青随着生长年限的增加，单株的块根产量稳步上升，尤其是从第1～2年，单株块根个数显著增加，分别增长73.13%与130.51%，而从第2～3年，单株的块根个数没有显著增加，主要是单个块根的重量增长。地上部的茎叶鲜重二年生三叶青显著大于一年生，三年生与二年生没有显著差异，茎叶鲜重的增长主要是主蔓长度的显著增加，分枝数没有显著差异。二年生的T/R比值与一年生相比显著下降。由上述得知，三叶青从第1～2年期间是快速生长累积阶段，而第2～3年长势趋于缓和，地上部生长趋于稳定，但块根产量继续增加。

表1 2种生态型三叶青农艺性状的比较

阔叶三叶青无论是一年生、二年生还是三年生，单株产量均高于窄叶三叶青。二年生与三年生的茎叶鲜重、块根总重显著高于窄叶三叶青，其中二年生样品差异达到极显著水平，2种生态型茎叶鲜重的差异主要由分枝数的差异所致，达到显著水平。

2.2 总黄酮含量的变化与比较

由图1可知，三叶青不同部位的黄酮积累量并不相同，以藤茎中的含量为最高。第1～2年黄酮含量变化最为显著，第2～3年则相对稳定。其中，二、三年生的三叶青块根黄酮含量显著低于一年生。二、三年生的藤茎、叶片黄酮则显著高于一年生。比较窄叶三叶青与阔叶三叶青黄酮含量发现，窄叶三叶青的黄酮含量除二年生与三年生的叶片外，其他不同年限、不同组织样品均显著高于相应的阔叶三叶青样品，其中以块根与藤茎中黄酮含量差异最大，达极显著水平。随着生长年限的延长，在块根中窄叶的总黄酮含量比阔叶依次高77.53%、29.89%、31.72%，在藤茎中则依次高出30.29%、31.93%、31.07%。

图1 2种生态型三叶青总黄酮含量的比较

3 讨论

三叶青作为重要的中药材入选新“浙八味”，一直以来以块根入药。野生的三叶青资源生长年限不清，无法为人工栽培经济效益的提高提供理论依据。本研究对三叶青进行人工栽培，对不同生长年限的产量，有效成分含量进行了系统的研究。一年生的三叶青虽然单位质量有效成分总黄酮含量高，但块根数量少，产量低，经济效益低下；而二、三年生三叶青产量增加极为显著，且二、三年生有效成分含量趋向稳定，适宜收获，尤其以三年生三叶青为最好。产量的逐年增加与已有研究具有一致性，而增幅差异可能与人工栽培方式的不同有关，这表明通过改善栽培方式能提高三叶青产量[9-10]。此外，关于三叶青总黄酮的研究多在块根上[11-13]。本研究通过对不同部位总黄酮含量的测定发现，在藤茎与叶片中的总黄酮含量积累也较高。结合产量农艺性状分析可知，藤茎中总黄酮含量逐年增加，可能因为藤茎较细小，生长慢，有效成分有逐年累积的趋势；块根从第1～2年快速增长，导致单位质量总黄酮含量显著下降；叶片新老交替快，黄酮含量变化较小。综上所述，三叶青全株积累有效成分类黄酮，适宜全草入药，以三年生三叶青经济效益高，适宜采收。

三叶青野生资源丰富，不同产地的三叶青有效成分含量并不相同，与生长环境有着必然联系。有研究表明，浙江产三叶青有效成分比广西产量高[7]，可见从野生三叶青资源能发掘优良种质。本研究引入的2种生态型三叶青分别表现为阔叶浅绿与窄叶深绿，其中窄叶三叶青总黄酮含量要高于阔叶三叶青，即品质较好，但阔叶三叶青在产量上明显优于窄叶三叶青，即产生的经济效益要高。可见，高产的三叶青资源并不意味着有效成分含量高。窄叶深绿性状是否与高有效成分含量相关，阔叶浅绿性状是否与高产相关仍值得深入研究。

4 小结

本研究表明，人工栽培三年生的三叶青块根产量高，经济效益好，适合采收。三叶青块根、藤茎、叶片中均积累了较高含量的有效成分类黄酮，适宜全株入药。窄叶与阔叶2种生态型三叶青进行统一人工栽培后，产量、有效成分并不相同，阔叶三叶青产量高，但有效成分含量低于窄叶三叶青，这对于从野生三叶青资源选育三叶青新品种意义重大。