通络驻景丸对糖尿病大鼠视网膜VEGF及其mRNA表达的影响

任翠翠 ，周云云 ，李高彪 ，李雨薇 ，艾华 ，雷晓琴

糖尿病性视网膜病变（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常见、最具破坏性的微血管病变，是临床常见的致盲性眼病之一。预计到2030年，全球DR的发病人数上升到1.9亿[1-3]。增殖性糖尿病视网膜病变 （proliferative diabetic retinopathy，PDR）是DR发展的一个严重阶段，以形成新生血管为主要特点，血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF） 是主要的促血管增生因子[4]。抗新生血管的生成对PDR的治疗至关重要[5-6]。通络驻景丸是在驻景丸的基础上由雷晓琴教授优化而成，对DR疗效确切[7]，并进行了深入的相关实验研究[8-9]。因此，本实验进一步从抗VEGF角度，探讨通络驻景丸干预糖尿病大鼠视网膜病变的作用机制，为该方的临床应用和进一步研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性SD健康大鼠，体重180~220 g，购于西安交通大学医学部实验动物中心，许可证号：SCXK（陕）2014-003。

1.2 试剂与药物

通络驻景丸（组成：熟地、菟丝子、车前子、三七、蒲黄、砂仁、地龙等），规格 10 粒/g，批号：20160406，西安交通大学医学部药学院提供。链脲佐菌素（CAS：18883-66-4，Sigma， 美国）；DAB 显色试剂盒（博士德生物技术有限公司，武汉）。兔抗小鼠VEGF单克隆抗体（中山生物技术有限公司，中山），VEGF ELISA 试剂盒（RapidBio，CA）等。

1.3 实验仪器

罗氏血糖仪和卓越金锐血糖试纸 （罗氏诊断有限公司，德国），Olympus BX51-DP71显微镜（Olympus，日本），电子天平（民桥精密科学仪器有限公司，上海）。

1.4 造模和分组

健康雄性SD大鼠适应性饲养一周，随机选取15只为空白对照组 （NC组），其余大鼠腹腔注射STZ造模。按1%STZ溶解于新鲜配制的柠檬酸缓冲液中，60 mg/kg体质量腹腔注射诱发糖尿病。NC组按60 mg/kg体质量腹腔注射柠檬酸缓冲液。整个过程无菌操作，10 min内完成。注射后30 min恢复进食。72 h后大鼠尾静脉采血测量血糖，剔除随机血糖低于16.7 mmol/L的大鼠。取造模成功的大鼠随机分为4组：模型组（DM组），通络驻景丸低、中、高剂量组（TLP-L组、TLP-M组、TLP-H组），每组15只。DM和NC组给予蒸馏水，TLP-L、TLP-M和TLP-H组分别按照通络驻景丸1.65 g生药/kg、3.33 g生药/kg、6.66 g生药/kg灌胃给药，给药容积2 ml/100 g体质量。每日灌胃一次，连续12周。

2 实验方法

2.1 血清中VEGF水平测定

末次给药1 h后，腹主动脉取血，室温静置2 h后3500 r/min离心分离血清，使用ELISA试剂盒测定血清中VEGF含量表达。具体步骤按照VEGF试剂盒说明书进行。

2.2 视网膜内VEGF mRNA表达检测

腹主动脉取血后，立即摘取眼球，一半眼球剥离视网膜后置-80℃冰箱保存，另一半用于免疫组化实验。采用荧光实时定量PCR法测定大鼠视网膜组织内VEGF mRNA表达的影响。VEGF mRNA表达以β-actin为内标来测算。引物序列见表1。

表1 Real-time-PCR引物序列

2.3 视网膜VEGF免疫组化检测

取上述2.2中的眼球，置多聚甲醛溶液中固定12 h，剥取视网膜，用于免疫组化实验。用SABC免疫组织化学染色试剂盒检测，具体操作步骤：①脱蜡和水化；②1份3%H2O2加蒸馏水10份混合，滴加在切片上，室温静置10 min；③抗原修复；④滴加5%BSA封闭液；⑤滴加一抗Anti-VEGF，4℃过夜；⑥滴加生物素化山羊抗小鼠IgG；⑦滴加试剂SABC；⑧DAB显色；⑨苏木精复染，脱水、透明、封片、镜检。通过图象分析系统进行量化分析。

2.4 统计分析

实验数据用SPSS 17.0统计软件分析，各组数据均为计量资料，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），若p＜0.05，则认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 血清中VEGF水平

与空白组相比，模型组中大鼠血清VEGF水平显著升高（p＜0.01），而给予不同剂量的通络驻景丸干预后，VEGF水平均有不同程度下降，其中，通络驻景丸高、中剂量组降幅最大（p＜0.01），见图 1。

图1 通络驻景丸对糖尿病大鼠血清VEGF水平的影响

3.2 视网膜VEGF mRNA表达水平

与空白组相比，模型组大鼠视网膜VEGF mRNA的表达显著升高（p＜0.01）。与模型组相比，不同剂量通络驻景丸组VEGF mRNA均有不同程度的降低，且通络驻景丸高、中剂量组降幅显著（p＜0.01），见图2。

图2 通络驻景丸对DR大鼠视网膜VEGF mRNA表达水平的影响

3.3 视网膜VEGF免疫组化

经免疫组化染色后，糖尿病大鼠视网膜上VEGF阳性表达呈现出深棕褐色着色颗粒。空白组主要在神经节细胞层中有弱的VEGF表达。与空白组相比，模型组在神经节细胞层、内丛状层及内核层外核层都有VEGF的较强表达（p＜0.01）。与模型组相比，通络驻景丸低剂量组VEGF的表达减弱（p＜0.05），通络驻景丸中、高剂量组表达减弱更显著（p＜0.01），提示通络驻景丸可减少糖尿病大鼠视网膜中VEGF的表达，见图3。

图3 DR大鼠视网膜VEGF免疫组化结果

4 讨论

PDR是一种以眼底视网膜新生血管形成为主要标志的糖尿病微血管并发症之一[10]。通常，DR被认为是一种细胞增殖性疾病，它的发生、发展和细胞的激活与增殖调控密切相关，新生血管本身也是细胞异常增殖的一种结果[11-12]。在众多血管生长因子中，VEGF是目前公认的最主要的促血管生长因子。研究认为，视网膜多种细胞，包括视网膜色素上皮细胞、Müller细胞、血管内皮细胞都能够产生VEGF[13-14]。正常生理状态下，视网膜内VEGF保持在较低的水平[15]。当机体维持在长期高血糖状态时，视网膜组织出现缺血缺氧，进一步激活VEGF的表达，从而引起内皮细胞增殖、血管管腔狭窄和闭塞、血流动力学改变，最终导致新生血管形成，DR病程不断恶化[16]。研究表明，糖尿病大鼠VEGF水平的降低可使增殖性糖尿病大鼠视网膜病变得到明显改善[17]。

中医认为，DR病机多为气血阴阳失调，以气阴两虚、肝肾不足、阴阳两虚为本，脉络瘀阻、痰浊凝滞为标。通络驻景丸源于中医经典古方驻景丸，雷晓琴教授基于对驻景丸、加减驻景丸、驻景丸加减方的深入研究、临床应用和动物实验的不断探索总结的基础上，创制形成通络驻景丸[18]。通络驻景丸具有滋阴活血、化瘀止血、通络明目之效，方中熟地黄、菟丝子滋阴补肾、养肝明目，车前子清虚热而明目，三七、蒲黄活血化瘀，墨旱莲滋补肝肾、凉血止血，砂仁化湿行气，地龙通经入络。诸药合用，共成滋补肝肾，化瘀止血之功，具有稳定血管内环境，发挥减轻DR病症的作用[19]。

课题组前期研究发现，通络驻景丸可有效减轻DM大鼠视网膜组织氧化应激损伤、抑制视网膜增殖，这一机制可能与Nrf2/ARE通路的激活以及Nrf2、HO-1蛋白表达有关[20]。本实验在前期研究基础上，通过链脲佐菌素（STZ）诱导大鼠糖尿病视网膜病变，进一步探讨通络驻景丸干预糖尿病大鼠视网膜VEGF表达的作用。结果显示，通络驻景丸干预12周后，大鼠血清中VEGF水平均显示不同程度的降低，且在视网膜组织中，VEGF mRNA和VEGF蛋白表达也显著降低，这种降低趋势呈现明显的量效关系，其中以高剂量组最为显著。提示通络驻景丸可以降低糖尿病大鼠血清和视网膜组织中VEGF水平，从而发挥抵抗新生血管生成的作用，延缓DR的病程的发展。

综上所述，本实验初步研究表明通络驻景丸能够在mRNA和蛋白表达水平显著降低糖尿病大鼠视网膜中VEGF水平，发挥抗新生血管作用，为通络驻景丸进一步应用与临床治疗提供实验依据。