钨酸钠对成熟期烤烟氮代谢、氧化胁迫和烟碱含量的影响

牛桂言，邵惠芳*，孙 双,王晓丽，曹丽君，韩 丹，黄五星，许自成

(1.河南农业大学烟草学院，河南 郑州 450002； 2.湖北省烟草公司襄阳市公司，湖北 襄阳 441000)

打顶是烟叶生产过程中必不可少的栽培措施，但是对于烟株来说打顶属于一种机械损伤。它会使烟株形成氧化胁迫[1]，改变烟株的碳氮代谢[2]，并进一步诱导烟碱的合成[3]。烟碱是烟叶的一种重要的化学成分，同时也与卷烟制品的吸味和刺激性密切相关。烟碱过高或过低，均不利于烟叶优良品质的形成[4]。由于烟田管理不当，以及打顶后烟株产生一系列生理变化及氮素的持续供应等原因，常导致烟叶后期贪青晚熟，烟叶烟碱含量过高，烟叶品质下降。

钨酸钠(Na2WO4)常被作为硝酸还原酶(NR)的抑制剂，主要是由于钨原子(W)的性质与NR的重要组成成分钼原子类似，而作用相反，因此可以取代NR复合体中的钼，从而达到抑制NR活性的作用[5-6]。目前以钨酸钠作为NR抑制剂的研究主要集中在其对叶类蔬菜，如小白菜、油菜等NR活性的调控以及对硝态氮含量的影响方面。其中杨荣等[7]的研究发现，Na2WO4抑制两个供试油菜品种根系NR活性的最佳浓度为1.0 mmol/L，同时影响根系对氮素的吸收速率。司江英等[8]的研究发现，0.8 mmol/L的Na2WO4处理能够降低小白菜的NR活性以及净光合速率。同时周碧燕等[9]的研究发现，在低温条件下喷施适量浓度的钨酸钠能够提高茶树叶片中渗透调节物质的含量和抗氧化酶活性。目前关于钨酸钠对打顶后烤烟形成的氧化胁迫、氮代谢以及对烟碱的调控尚未报道。

湖北南漳烟区烟叶生长后期温度较低，降雨较多，土壤氮素后期持续供应，导致烟叶成熟度较差，贪青晚熟，烟碱含量过高，不利于烟叶优良品质的形成，降低工业可用性。因此，本试验通过对生长过旺的烟叶喷施不同浓度的Na2WO4，研究其对打顶后烟株氮代谢、氧化胁迫及烟碱含量的影响，以期为解决后期烟叶贪青晚熟、提高烟叶品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2016年5～9月于湖北省襄阳市南漳县薛坪镇进行。南漳位于湖北西北部，试验地薛坪镇海拔700 m左右，供试品种为当地主栽品种K326。供试土壤为黄壤土，基础土壤养分状况为：有机质43.57 g/kg，碱解氮161.53 mg/kg，有效磷29.95 mg/kg，速效钾282.00 mg/kg，pH值7.34。

1.2 试验设计

试验设4个处理，钨酸钠喷施浓度分别为0、0.5、1.0、1.5 mmol/L，分别用CK、T1、T2、T3表示。各处理均于烟株打顶当天16：00以后进行整株叶面喷施，叶背、叶面均匀喷施，每个处理100株。在打顶当天及以后每隔10 d进行农艺性状的测定，在打顶当天、打顶后1 d及做喷施处理后每隔10 d进行烟叶样品的采集，共取5次，用以对烟叶进行生理各项指标的测定。烟苗于当地5月10日采取井窖式方式进行移栽，株距55 cm，行距110 cm，7月21日打顶，单株留叶数在20～22片左右。试验地田间管理按当地优质烟叶生产管理进行。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 烟株根系活力的测定

烟株根系活力采用TTC方法测定[10]。

1.3.2 烟叶氮代谢关键酶活性的测定

选取具有代表性的烟株，对中部叶(10～12叶位)进行鲜样的采集。剪取距离叶尖1/3处两支脉之间鲜烟片，将每个处理烟样混合均匀后用铝箔纸和纱布裹好，迅速置于液氮中保存，带回实验室进行酶活的测定。硝酸还原酶(NR)采取活体法进行测定[11]，谷氨酰胺合成酶(GS)采用分光光度法测定[12]。

1.3.3 烟叶抗氧化酶活性及丙二醛含量的测定

取样方法与氮代谢酶相同。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑还原法测定[13]，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定[13]。丙二醛(MDA)的含量采用硫代巴比妥酸法测定[13]。

1.3.4 烤后烟叶烟碱的测定

每个处理选取烤后烟叶C3F和B2F等级各1 kg，粉碎后过0.25 mm筛。烟碱含量采用比色法测定[14]。

1.4 数据处理

采用Excel 2016进行图、表的制作，运用SPSS 21.0进行方差分析和多重比较。采用模糊数学隶属函数法对不同浓度钨酸钠处理对烟叶的调控效果进行综合评价。当指标与调控效果呈正相关时，隶属函数的计算公式为：R(Xi)=(Xi-Ximin)/(Ximax-Ximin);当指标与调控效果呈负相关时，隶属函数的计算公式为：R(Xi)=1-(Xi-Ximin)/(Ximax-Ximin)。i=1，2，…，n。公式中Xi为i处理某指标测定值，Ximin为该指标所有处理的最小值；Ximax为该指标所有处理的最大值。最后将每处理组所有指标的调控效果的隶属函数值进行累加，求其平均数，值越大代表调控效果越好。

2 结果与分析

2.1 不同浓度钨酸钠处理对烟株根系活力的影响

在打顶后的3个时期，不同浓度钨酸钠处理的烟株根系活力均低于对照处理，同一时期随着钨酸钠浓度的增加其对根系的抑制作用逐渐增强(表1)。打顶当天，与对照相比，不同浓度钨酸钠处理的烟株根系活力间无显著差异；打顶后10 d，T2和T3处理较对照显著降低，分别降低了21.83%和24.82%；打顶后20 d，T1、T2和T3处理较对照显著降低，分别较对照降低16.90%、36.00%和41.57%；打顶后30 d，T2和T3处理较对照显著降低，分别为对照的69.66%和65.25%。

表1 不同浓度钨酸钠处理对烟株根系活力的影响 [μg/(g·h)]

注:表中不同小写字母表示处理间差异达到0.05%显著水平。下同。

2.2 不同浓度钨酸钠处理对烟叶氮代谢关键酶活性的影响

2.2.1 不同浓度钨酸钠处理对烟叶NR活性的影响

随着打顶时间的推移，NR活性的整体变化规律表现为先增高后降低，与对照相比，同一时期随着钨酸钠浓度的增加NR活性显著下降(表2)。打顶当天各处理间无显著差异；打顶后10 d各处理NR活性达到最大值，其中T2和T3处理显著低于对照，较对照分别降低11.34%、17.47%；打顶后20 d，处理T1、T2、T3较对照显著降低，分别为对照的82.72%、73.55%、64.07%，且此时期NR活性较上一时期的降低幅度最大，降幅依次表现为T3(48.14%)>T2(44.59%)>T1(42.75%)>CK(33.20%)；打顶后30 d，各处理NR活性降为最小值，T2、T3处理显著低于对照，分别较对照降低了29.40%、50.00%。

表2 不同浓度钨酸钠处理对烟叶NR活性的影响 [μg/(g FW·h)]

2.2.2 不同浓度钨酸钠处理对烟叶GS活性的影响

随着打顶时间的推移，GS活性的变化规律与NR活性的变化规律表现基本一致，同一时期，当钨酸钠浓度为0.5～1.0 mmol/L时，GS活性随着钨酸钠浓度的增高而显著降低，当浓度增加为1.5 mmol/L时，GS活性的降低效果不显著(表3)。其中，打顶当天各处理间差异不显著；打顶后10 d，各处理GS活性达到最大值，其中处理T2、T3较对照显著降低，分别为对照的69.05%、67.91%；打顶后20 d，与对照相比，处理T2和T3显著降低，分别较对照降低了28.62%、34.07%；打顶后30 d各处理的GS活性均降低到最小值，其中处理T2和T3较对照显著降低，分别较对照降低了39.02%、34.14%。

表3 不同浓度钨酸钠处理对烟叶GS活性的影响 [A/(mg Protein·h)]

2.3 不同浓度钨酸钠处理对烟叶抗氧化系统的影响

2.3.1 不同浓度钨酸钠处理对烟叶SOD活性的影响

打顶后1 d烟叶SOD的活性明显增加，打顶后10～30 d，各处理SOD活性变化规律不尽一致。处理CK、T1、T3在打顶后1 d达到最大值，处理T2在打顶后20 d达到最大值(图1)。其中，打顶当天各处理间无显著差异；打顶后1 d SOD活性的增幅较大，以处理T2显著增加，增长幅度达到49.32%。在打顶后1 d到打顶后10 d这一时间段，SOD活性相对较稳定，处理T2的SOD活性稍有升高，其他处理则稍有下降。打顶后1、10、20 d，与对照相比，均以处理T2显著高于对照，分别较对照增加了13.60%、32.69%、37.50%；打顶后30 d各处理SOD活性均下降，处理T2显著下降，降幅为35.83%。

图1 不同浓度钨酸钠处理对烟叶SOD活性的影响

2.3.2 不同浓度钨酸钠处理对烟叶POD活性的影响

随着打顶时间的推移，烟叶POD活性表现为先升高后降低的变化趋势(图2)。打顶当天，各处理间未达到显著差异；打顶后1 d，各处理的POD活性均达到最大值，处理T2增加较多，增幅达到19.68%；打顶后10 d，处理T2较对照显著增加，较对照增加了34.21%；打顶后20 d，处理T1、T2、T3较对照显著增加，分别较对照增加了20.29%、27.25%、17.39%。在打顶后30 d POD活性降低到最小值，各处理间未达到显著差异，此时期各处理的降幅具体表现为T2(31.30%)>T1(31.19%)>T3(30.39%)>CK(14.85%)。

图2 不同浓度钨酸钠处理对烟叶POD活性的影响

2.3.3 不同浓度钨酸钠处理对MDA含量的影响

随着打顶时间的推移，MDA含量呈一直增加的趋势(图3)。打顶后1 d，处理T1与对照相比显著降低，较对照降低了17.11%；打顶后10～20 d，MDA含量均以处理T2最低，与对照相比差异显著，较对照分别降低了26.59%、26.85%，且这两个时期间MDA含量差异较小，变化幅度不超过5%；打顶后30 d MDA含量达到最大值，比打顶当天增加了将近1倍，与对照相比，处理T3的MDA显著降低，较对照降低了13.40%。

2.4 不同浓度钨酸钠处理对不同部位烟碱含量的影响

喷施不同浓度的钨酸钠的上、中部位烟叶的烟碱含量均低于对照，且钨酸钠的浓度越高烟碱含量越低(图4)。与对照相比，不同浓度的钨酸钠处理的上部叶烟碱含量均显著低于对照，分别是对照的77.06%、61.77%、54.43%。同时，与对照相比，中部叶烟碱含量以处理T2、T3显著低于对照，较对照分别降低了37.62%、41.91%。

图3 不同浓度钨酸钠处理对烟叶MDA含量的影响

图4 不同浓度钨酸钠处理烤后不同部位烟叶烟碱含量

2.5 不同浓度钨酸钠处理对烟叶各项指标的综合评价

采用模糊隶属法对喷施不同浓度的钨酸钠的烟叶各项指标的变化进行综合性评价，计算各指标其隶属函数值，然后求各处理平均隶属函数值，其平均隶属函数值越大，代表其调控效果越好。不同处理对烤烟成熟期各项指标调控效果最好的是T2处理，具体表现为T2>T3>T1>CK(表4)。

表4 不同浓度钨酸钠处理对烟叶各项指标的综合评价

3 讨论与结论

烟株的前期生长主要以氮代谢为主，这有助于烟株的生长发育和干物质的积累，打顶后烟株碳氮代谢发生转变，有利于烟叶生长后期的成熟和品质的形成[15]。NR和GS是烟株氮代谢的关键酶，它们的大小在一定程度上是氮代谢强弱的直接反映[16-17]。本试验结果表明，喷施Na2WO4能够显著减弱NR的活性，这与黄海涛等[18]、杨荣等[7]的研究结果一致。同时Na2WO4减弱了打顶后生长过旺烟株的根系活力，这与周万海等[19]在研究钨酸钠对苜蓿根系生长的结果一致。说明Na2WO4能在一定程度上抑制烟株的氮代谢和根系活力，有利于减缓打顶后生长过旺的烟株对氮素的持续利用，防止烟株过分的贪青晚熟。

在烟草打顶以后会使烟株产生氧化胁迫，其体内会产生防御反应，来阻止氧化胁迫对自身细胞的毒害。目前已经利用转基因的方法，来减少氧化胁迫的危害[20-21]。通常情况下，植株遭受氧化胁迫时，主要通过对抗氧化酶系统的调控来应对，对黄瓜[22]、辣椒[23]、黑麦草[24]等多种作物的研究均发现，提高抗氧化酶活性，有利于减少活性氧的生成。SOD、POD是活性氧清除系统中重要的抗氧化酶。SOD主要作用是催化超氧阴离子自由基，使其发生歧化反应，分解为过氧化氢和氧气，POD主要是通过催化过氧化氢与底物发生反应，起到清除过氧化氢的作用，从而减少对细胞的毒害作用[25-26]。但也有研究表明，POD的功能具有两面性，它参与活性氧的产生，并能引发膜脂过氧化[27-28]。MDA是膜脂过氧化的产物，其含量多少在一定程度上代表着膜脂质过氧化水平，同时还与烟叶的衰老程度相关[27]。本研究结果表明，打顶后喷施Na2WO4烟株的SOD、POD的活性均表现为先升高后下降。除打顶后30 d，Na2WO4处理烟株的SOD和POD活性均显著高于对照，以T2、T3处理较高，这有利于对打顶后烟株活性氧的清除。在打顶后30 d时两种酶活性降低且各处理差异不显著，可能是由于此时烟叶已经接近成熟。MDA含量一直升高，钨酸钠处理烟株的MDA含量均低于对照，以处理T2较对照显著降低。MDA含量后期增幅较小，这可能是与此时期抗氧化酶活性的升高有关。说明喷施Na2WO4可以提高抗氧化酶的活性，降低MDA含量，对缓解打顶后烟株的氧化胁迫具有重要作用。

烟株打顶可以诱导烟碱合成，主要是氧化胁迫后生成的茉莉酸刺激了烟碱合成酶的活性，导致烟叶的烟碱含量增多[29-30]。本试验结果发现，Na2WO4浓度越高降低烟碱能力越强，上部叶和中部叶均以T3处理最好，T2次之。烟碱含量的降低，除了与打顶后抗氧化酶活性有关[31-32]，可能也与钨酸钠减弱烟株的氮代谢和根系活力相关[33]。

本试验结果表明，对打顶后生长过旺的烟株喷施Na2WO4，能够提高烟叶抗氧化酶的活性，减弱打顶后烟株的氮代谢、根系活力、MDA和烟碱含量。同时通过对各项指标的综合评价发现喷施1.0 mmol/L的钨酸钠的效果最佳，但是关于钨酸钠对影响烟株烟碱合成的机理有待于进一步研究。