盐胁迫环境下接种根际促生细菌对碱蓬根际土壤微环境特征的影响

井大炜，马海林，刘方春，杜振宇，贾海慧，马丙尧，王春丽,郭英华，丁洪星

(1.德州学院资源环境与规划学院，山东 德州 253023；2.山东省林业科学研究院， 山东 济南 250014；3.德州学院生态与园林建筑学院，山东 德州 253023； 4.山东和信德检测技术有限公司，山东 济南 250101；5.济南市国有苗圃， 山东 济南 250100；6.济南花木联合开发公司，山东 济南 250100)

我国为世界盐碱地大国，盐渍土面积高达9.91×107hm2，约占国土面积的1.03%[1-2]。盐渍化土壤不仅对农林业造成很大的威胁，而且会引起土壤退化，导致土地利用率急剧下降。面对土壤退化、世界人口剧增与淡水匮乏的全球性生态问题，如何开发与利用盐碱地资源已成为农林业科学研究者关注的重大课题[3-4]。近年来，许多研究者针对盐碱地改良进行了大量的尝试，并积累了一定的盐碱地改良技术[1]。

植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)指生存在植物根圈微域内，对病原菌有拮抗或对植物生长有促进效应的有益细菌的统称，对病害防治与植物生长有极其重要的作用[5]。PGPR具有降解土壤中污染物的作用，并减少生产中使用化肥、农药带来的环境污染与土壤板结等问题[6]。有研究发现[7]，接种产生长素或产羧酸脱氨酶的PGPR，对作物生长有显著的促进作用。也有研究表明[8]，接种PGPR有利于改善植物根际生态环境，并能明显促进根系生长。可见，PGPR的开发研究正逐渐得到了越来越多的重视，但有关PGPR在盐胁迫环境中对根际微环境特征影响的研究较少。

林木根际是各种养分、水分与各种物质进入根系参与物质循环和能量转化的重要场所之一[9]。植物根际土壤微生物有助于增加土壤有机质与总氮含量，并增强植物的抗逆性[10-11]。土壤盐渍化不仅可以直接影响微生物的活性，还能通过改变土壤的理化性状影响微生物的生存环境，进而影响微生物的种类与数量[12]。因此，近年来诸多学者认为[5,12]，积极改善土壤微生态环境，充分协调根际土壤中微生物的数量与多样性，有利于增强植物对逆境胁迫环境的耐受性。同时，维持土壤微生物多样性对于提高农林业生产力、抑制土传病害与增强土壤缓冲能力具有重要意义[13]。碱蓬(Suaedaglauce)是藜科(Chenopodiaceae)碱蓬属(Suaeda)植物，可增加土壤中氮、磷、钾与有机质含量，并能消除裸露盐碱荒滩，有效防止水土流失，对于保持与重建盐地生态具有十分重要的作用[14-15]。为此，本文选取蜡样芽孢杆菌为供试菌株，以碱蓬为试材，开展不同盐胁迫梯度下接种PGPR对碱蓬根际土壤微环境特征的影响研究，旨在明确PGPR对碱蓬耐盐性的改善效果，为盐胁迫环境下PGPR的推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点与供试材料

试验地点选在山东省德州市农业科学研究院试验大棚，供试土壤为潮土，土壤碱解氮含量32.87 mg/kg，有效磷含量28.06 mg/kg，速效钾含量86.50 mg/kg，有机质11.93 g/kg，可溶性盐分为0.069 5%，pH值 8.06。供试碱蓬为1年生实生苗，株高(12.56±3.92)cm，地径(0.14±0.02)cm。

利用梯度稀释法与三区划线法从碱蓬的根际土壤中分离并纯化出细菌分离物，然后参考Liu等[8]的生物法(小麦叶片保绿和萝卜子叶增重)筛选出1株促生效果较好的植物根际促生细菌，结合其生理生化特征与16S rRNA基因序列分析，综合鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)TPR033。将该菌株接入牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH值7.0～7.2)中，于37 ℃、180 r/min条件下振荡培养2～3 d。然后，接种到液体培养基(乳糖2%，蛋白胨2%，K2HPO40.15%，MgSO4·7H2O 0.02%，CaCl20.01%，pH值6.2～6.8)中，接种量10%，于30～35 ℃摇床培养，转速180 r/min，培养12 h，利用平板计数法测定每毫升的含菌数量，并计算菌液浓度，统一稀释至2×108CFU/mL。

1.2 试验设计

盆栽试验于2016年6月4日开始，选出长势基本一致的苗木进行盆栽，盆大小规格为：高20 cm、直径30 cm。每盆称土9.8 kg。试验共设7个处理，分别为：1)CK：对照，不加NaCl和PGPR；2)LS：轻度盐胁迫，盐分质量分数10.0 g/kg；3)MS：中度盐胁迫，盐分质量分数15.0 g/kg；4)SS：重度盐胁迫，盐分质量分数20.0 g/kg；5)LS+P：在处理2的基础上加入PGPR菌液；6)MS+P：在处理3的基础上加入PGPR菌液；7)SS+P：在处理4的基础上加入PGPR菌液。重复5次。处理5、6、7是分别取PGPR菌液10 mL，稀释至150 mL，均匀浇灌于碱蓬苗根系周围；然后浇水至75%的田间持水量，每天按时浇水，保持土壤含水量为田间持水量的65%～70%。

1.3 测定项目与方法

在2016年9月30日采用剥落分离法[5]采集根际土，并将所取根际土样混匀后分成3份：一份新鲜样品用于微生物数量和微生物量碳、氮的测定，一份样品风干后过1 mm筛后用于根系分泌物的分析，另一份放于-80 ℃的冰箱中保存用于微生物多样性指数的分析。

根系分泌物中氨基酸总量、有机酸总量与总糖分别采用甲醛滴定法、液相色谱仪法与蒽酮比色法进行测定[16]；土壤微生物数量采用稀释平板计数法，细菌、放线菌或真菌的测定分别采用牛肉蛋白胨琼脂培养基、改良高氏1号培养基或马丁-孟加拉红培养基。土壤微生物量碳、氮的测定采用氯仿熏蒸K2SO4浸提法[16]。土壤微生物群落多样性采用Biolog GN平板分析法测定[13]。同时，根系体积采用排水法测定；根系总吸收面积、活跃吸收面积采用甲烯蓝吸附法[17]测定。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，采用双因素方差分析(two-way ANOVA)与最小显著差异法(LSD)比较不同处理组间的差异，显著性水平设定为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 根际土壤中根系分泌物总含量

从表1可见，碱蓬根际土壤根系分泌物中的有机酸总量与氨基酸总量呈现出基本一致的变化规律。同CK相比，LS处理的有机酸总量、氨基酸总量变化较小，而MS和SS处理则显著降低了有机酸总量和氨基酸总量；当接种PGPR后，对应的有机酸总量、氨基酸总量均显著升高，以LS+P处理的有机酸总量、氨基酸总量为最高，并显著高于其他处理，其中有机酸总量分别较CK、LS、MS、SS、MS+P和SS+P处理提高14.57%、15.36%、39.28%、69.32%、27.38%和42.95%。SS+P处理的有机酸总量、氨基酸总量与MS处理差异不显著。此外，各个处理的总糖含量并未表现出明显差异。由此可知，随土壤盐分梯度的增加，碱蓬根际土壤根系分泌物中的有机酸总量和氨基酸总量呈递减的变化趋势，而接种PGPR能使对应的指标显著升高。

表1 不同处理对碱蓬根际土壤中根系分泌物总含量的影响

注：数据为平均值±标准差，同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同。

2.2 根际土壤微生物数量与微生物量碳、氮含量

从表2可见，在盐胁迫环境中，碱蓬根际土壤的微生物数量明显降低，且微生物数量随土壤盐分梯度的增加而降幅变大。同CK相比，LS、MS和SS处理的细菌数分别下降8.04%、22.89%和37.78%。当接种PGPR后，各处理对应的细菌数和放线菌数显著增加，而真菌数变化幅度较小。LS+P处理的细菌数、放线菌数和微生物总量均为最高，并显著高于其他处理，分别较CK显著高出12.80%、24.77%和15.81%。土壤微生物总量的变化趋势类似于细菌数。此外，不同处理的微生物量碳、氮含量表现出相似的变化趋势，加菌液处理均显著高于对应的不加菌液处理，其中LS+P处理的微生物量碳、氮含量显著高于其他处理。上述结果显示，土壤盐胁迫易引起碱蓬根际土壤微生物数量与微生物量碳、氮含量的显著下降，而接种根际促生细菌可减弱盐分胁迫的影响，其中轻度盐胁迫下接种的效果最为显著。

表2 不同处理对碱蓬根际土壤微生物数量与微生物量碳、氮含量的影响

2.3 微生物多样性指数

从图1可见，随土壤盐分强度的加大，碱蓬根际土壤的微生物多样性指数呈递减趋势，当接种PGPR后，加菌液处理的微生物多样性指数均显著高于对应的不加菌液处理，其中LS+P处理的微生物多样性指数最高，依次为CK、LS、MS和SS处理，且各处理之间的差异均达显著水平，这与微生物总量的变化规律一致；而MS+P处理的微生物多样性指数与CK差异不显著，SS+P处理与LS处理无显著性差异，这与微生物总量的变化规律不完全一致，其原因可能是中度、重度盐胁迫使碱蓬的微生物多样性指数降低，而添加PGPR则能显著增加对应的微生物多样性。表明接种根际促生细菌可以改善根际环境，并对各类微生物的作用效果有差异，导致土壤中微生物总数与微生物多样性指数的变化趋势不一致。以上分析认为，轻度盐胁迫下接种蜡样芽孢杆菌能显著提高碱蓬根际土壤的微生物多样性指数，且增幅显著高于其他处理。

图1 不同处理对碱蓬根际土壤微生物多样性指数的影响

2.4 根系吸收面积

从表3可知，随土壤盐分强度的增加，碱蓬的根体积、总吸收面积与活跃吸收面积呈逐渐降低的趋势，且降幅越来越大。当接种PGPR后，加菌液处理的根体积、总吸收面积与活跃吸收面积均显著高于对应的不加菌液处理，其中LS+P处理的根体积与CK无显著性差异，而总吸收面积、活跃吸收面积分别显著高于CK 8.33%、28.24%；同时，LS+P、MS+P和SS+P处理的根系指标表现出递减的变化趋势。从表3还可见，LS+P处理的活跃吸收面积/总吸收面积比值显著高于其他处理，其次为CK、MS+P和SS处理，而LS、MS和SS+P处理之间差异不显著。数据分析显示，在不同梯度的盐胁迫环境下接种根际促生细菌能不同程度地提高碱蓬根系的总吸收面积与活跃吸收面积，其中在轻度盐胁迫下接种的效果最明显，这更利于促进根系对水分、养分的吸收。

表3 不同处理对碱蓬根系总吸收面积与活跃吸收面积的影响

3 小结与讨论

林木根际是林木根系-土壤-微生物相互作用的特殊微生态环境，根际土壤微生物数量与种类是表征土壤肥力的重要生物学指标[11,13]。本试验针对碱蓬设置了10.0、15.0和20.0 g/kg 3个盐分梯度，结果表明20.0 g/kg盐分梯度时碱蓬的生长受到了显著抑制，并出现死亡现象，而李强等[18]关于NaCl胁迫对碱蓬幼苗生长的研究认为，当盐分含量≥25.0 g/kg时才出现幼苗死亡现象，这与本研究结果不完全一致，可能与碱蓬的种类、土壤性状和试验周期等因素的差异有关。本试验中，盐胁迫导致碱蓬根际土壤微生物数量显著下降，且随胁迫梯度的增加，降幅越来越大，这与刘磊等[12]盐胁迫对甜菜根际土壤微生物数量的研究结果基本一致。表明碱蓬根际土壤中的微生物种群对周围盐分浓度的变化较敏感，土壤盐胁迫使土壤微生物生境发生了变化，从而使其种群数量受到了影响[19]。在碱蓬生长过程中，根系在从土壤中吸收养分与水分的同时，亦会向土壤中释放无机离子、分泌质子或溢泌有机物[11]，即根系分泌物。本研究中，接种PGPR能使对应的微生物数量显著提高，究其原因与接种蜡样芽孢杆菌能促使碱蓬根系分泌物的增多有密切关联，这为微生物的快速生长繁殖提供了营养物质与能量来源。其中在轻度胁迫下接种的效果最为显著，其次为中度或重度胁迫下接种，说明低盐环境可能更利于根际促生细菌的定植与繁殖生长。

生物多样性指数可在一定程度上表征生物群落中物种的丰富程度与各类型间的分布比例[13]。本试验中，MS+P处理的微生物多样性指数与CK差异不显著，SS+P处理与LP处理无显著性差异，这与微生物总量的变化规律不一致。其原因在于不同处理使碱蓬根际微环境对各类微生物的影响作用存在差异，可能仅适宜某一类或几类微生物的生长，而对其他类微生物则并无作用[10]。中度、重度盐胁迫导致碱蓬的微生物多样性指数降低，而接种根际促生细菌则能明显增加对应的微生物多样性，进而导致土壤微生物多样性指数与微生物总量的变化趋势不同步。本研究还表明，LS+P处理的微生物多样性指数显著高于其他处理，这与该处理能显著提高根系分泌物中的有机酸和氨基酸含量有关，进一步印证了蜡样芽孢杆菌在轻度盐胁迫下更利于快速繁殖，其作用效果显著优于中度或重度盐胁迫。

当植物受到盐胁迫时，根系首先感应到根际土壤的变化。植物根系是活跃的吸收器官与合成器官，根系吸收面积可反映根系吸收水分与养分的能力，而根系活跃吸收面积则可表征根系活力的状况[17]。本试验中，盐胁迫导致碱蓬根系的总吸收面积与活跃吸收面积显著降低，而接种PGPR使对应的根系总吸收面积与活跃吸收面积显著升高。这是由于该促生细菌显著增强了碱蓬的根系活性，同时还能明显改善土壤微生态环境条件[7]，从而为根系生长创造了优越的环境条件。同时发现，LS+P处理的根系总吸收面积与活跃吸收面积显著高于其他处理，这是因为蜡样芽孢杆菌在轻度盐胁迫下对碱蓬根系活性的刺激作用明显强于中度、重度盐胁迫。这对于增强碱蓬根系对养分、水分的吸收能力，进而提高碱蓬的耐盐性具有重要指导意义，也为进一步促进碱蓬在盐胁迫生境下的生长提供了新思路。