大熊猫源枝孢样枝孢霉野生株(Z20)与突变株(Zt)部分生物学特性及药敏试验比较

马晓平，杨秋霞，俞 演，李德生，王承东 ，凌珊珊，古 玉

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都611130； 2.中国大熊猫保护研究中心，四川 雅安 625000; 3.四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安 625014)

枝孢样枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)属于引起暗色丝孢霉病的枝孢霉属暗色孢科真菌[1]。其在环境中浓度较高，一般不会对机体产生威胁，在特定条件下能够引起人和动物的浅部感染，是近30年才报道的条件性致病暗色真菌。近年来随着环境变化以及各种抗生素等药物的滥用，由枝孢样枝孢霉引起人和动物的暗色丝孢霉病越来越多，世界各国先后报道了由该菌引起的人和动物的皮下真菌病[2]、角膜炎[3]、鼻窦炎、脑炎、肾炎[4]等多种疾病。2012年马晓平等[5]发现了一例由枝孢样枝孢霉引起的大熊猫皮肤病。对枝孢样枝孢霉的免疫原性研究中发现枝孢样枝孢霉的分生孢子体和菌丝体中所含的过敏原成分基本相同，而在分生孢子内的过敏原总浓度高于菌丝提取物的过敏原总浓度[6]。但由于对枝孢样枝孢霉的基本微生物学特性及致病机制缺乏了解，对由该菌引起疾病的诊治仍是难点。本课题组在大熊猫皮肤病灶上分离出致病菌枝孢样枝孢霉Z20，在此基础上，通过微波结合亚硝基胍诱变的方式获得了相对于原菌株表型改变，对小鼠致病力减弱的弱毒株Zt[7]。本次实验对枝孢样枝孢霉野生株(Z20)和突变株(Zt)培养特性、形态学、菌丝多糖含量、药物敏感型作了进一步的研究，为其诊断、治疗、预防以及致病机制的研究做铺垫。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

供试菌株Z20为大熊猫皮肤病患处分离并鉴定的枝孢样枝孢霉纯菌株(登录号：JQ727688.1)；Zt为通过微波诱变结合亚硝基胍诱变获得的突变株(登录号：KR084328)，均由本实验室提供。

1.2 主要仪器

MJ-400B霉菌培养箱购自苏州净化设备科技有限公司；CP214电子天平购自上海奥豪斯仪器有限公司；THZ-C恒温振荡仪购自太仓市实验设备厂；BX51荧光显微镜及DP70照相系统购自日本奥林巴斯；H-600A-2型透射电镜购自日本日立；以及其他实验室常规设备。

1.3 主要试剂及培养基

1.3.1 主要药品试剂

RPMI-1640培养基购于成都康迪生物技术有限公司；二甲亚砜(DMSO)、灰黄霉素(Y29J7C9597)、酮康唑(SM0325YF13)购于上海源叶制药厂；环吡酮胺(P02854)购于阿达玛斯；氟康唑(RK4168S305)、伊曲康唑(RK2186S31)购于上海瑞勇制药厂。根据M-38A配置灰黄霉素、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、磺吡酮胺储存液，氟康唑水溶性溶于无菌水，其余4种药物脂溶性溶于二甲亚砜[8]。

1.3.2 主要培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、沙保罗培养基(SDA)制备法见参考文献[9]。

2.5%戊二醛固定液配制。(a) 0.2 mol·L-1磷酸缓冲液的配方：准确称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)2.6 g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)29 g，加入蒸馏水至500 mL，用1 mol·L-1HCl 将pH调至7.4。(b) 取25%戊二醛10 mL，0.2 mol·L-1磷酸缓冲液50 mL， 蒸馏水约40 mL定容至100 mL配得2.5%戊二醛。

1.4 菌落形态学及生长速率的测定

将保存菌株Z20与Zt分别接种于SDA培养基上进行复苏，培养7 d后用灭菌打孔器沿菌落边缘切下直径5 mm的菌块接种于灭菌的PDA培养基上，于25 ℃培养箱中培养。每天观察菌株的颜色、质地、形态、生长快慢，十字交叉法测量菌落大小，每个处理重复3次。用透明胶带黏取菌落经乳酸棉蓝染色后显微镜观察。

1.5 枝孢样枝孢霉Z20与Zt的超微形态结构比较

按常规方法制作透射电镜标本进行观察[10]。将复苏后的菌株Z20和Zt接种于沙氏培养液中25 ℃，150 r·min-1常规培养，取对数生长期的菌落，离心去掉培养液，用灭菌生理盐水冲洗3次，投入2.5%的戊二醛固定液中室温下固定6 h并制成琼脂块，经1%锇酸后固定、滴膜、常规方法脱水(乙醇-丙酮系列梯度脱水)、定向包埋(Epon-812包埋剂包埋)、超薄切片(60～80 nm)，经醋酸铀-枸橼酸铅双染色后，在H-600A-2型透射电镜下观察，拍照。

1.6 菌丝体多糖含量测定

标准曲线的制定：精确称取已干燥至恒定质量的葡萄糖40.0 mg，加入适量水溶解，于100 mL容量瓶中定容，摇匀，配成浓度为400 μg·mL-1的标准葡萄糖储备液。使用时，再分别稀释成50、100、125、150、175、200、250、300 μg·mL-1的使用浓度，准确移取蒸馏水0.2 mL和上述葡萄糖使用液各0.2 mL置于干燥的具塞试管中，加入0.05 g·mL-1苯酚溶液0.8 mL，混合均匀后，迅速加入4 mL浓硫酸，混匀后，室温放置30 min，在波长为485 nm处测定吸光度，以加入蒸馏水的溶液做空白。以葡萄糖的浓度(μg·mL-1)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制吸光度-葡萄糖浓度关系曲线[11]。

菌丝体多糖制备：取菌丝体置于预冷无菌的研钵中，在冰浴下研磨至粉末，称取0.4 g粉末菌体，至滤纸袋中，用40 mL 85%乙醇于60 ℃浸提30 min，重复2次，弃乙醇后加入20 mL蒸馏水，沸水浴中提取2 h后定容至100 mL。按标准曲线测定方式测定菌丝体的吸光度值，并测定菌丝体的多糖含量。

1.7 常见抗真菌药物的MIC测定

1.7.1 菌悬液的制备

取于SDA培养基上培养1周的菌株Z20和Zt，各自用1 mL灭菌生理盐水反复冲洗吹打菌落表面，将菌悬液用双层无菌纱布滤掉菌丝，将菌悬液置于无菌试管中，振荡混匀，用血球计数板调整菌悬液浓度为(0.40～5.00)×106cfu·mL-1，再用RPMI-1640培养基将菌悬液进行1∶50稀释为2倍浓度的菌悬液，4 ℃冷藏备用。

1.7.2 药敏板的制备

药物稀释：5种抗真菌药物灰黄霉素、伊曲康唑、酮康唑、环吡酮胺、氟康唑。氟康唑用灭菌蒸馏水配成1 600 μg·mL-1，其余4种药物(非水溶性药物)用100%的二甲亚砜(DMSO)溶解配成1 600 μg·mL-1的储备液，-20 ℃保存备用。灰黄霉素和氟康唑的药物浓度使用范围0.125～64.000 μg·mL-1，伊曲康唑、酮康唑和磺吡酮胺的使用范围0.0313～16 μg·mL-1。

1.7.3 菌悬液接种及结果判读

将制备好的药敏试验板在室温下溶解，在96 孔板的1-11列中每孔加入100 μL的2 倍终浓度的菌悬液，11列为生长对照，含有100 μL菌悬液与100 μL培养基，12列为阴性对照，只含有200 μL RPMI1640培养基。将药敏试验板置于25 ℃培养(静置)，5～7 d读取结果。结果判定的前提为第12 孔阴性对照培养基清晰透明，11列生长对照生长良好，将每孔生长情况与11列对比，若该孔出现浑浊，那么前1孔的药物浓度判定为相应菌株的MIC值。重复3次，结果由2人在光线较好的条件下判读，取平均值。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态学及生长速率变化

枝孢样枝孢霉Z20与Zt分别接种于PDA培养基上连续培养，突变株表面为灰白色绒毛状，边缘为白色菌丝；野生株表面为深灰色，边缘有少量白色菌丝。随着时间加长，突变株边缘白色菌丝减少，中部呈现橄榄绿色；野生株表面皱褶加深(图1)。

将菌株Z20与Zt培养4 d后用棉蓝染色进行显微镜下观察，Z20与Zt菌丝无明显变化，均为分隔菌丝，有分枝。野生株菌株Z20孢子量高于突变株，孢子形态无明显变化(图2)。

培养第1天Z20与Zt生长均缓慢，突变株Zt的速率略高于野生株Z20，培养第2天之后突变株的生长速率快于野生株的生长速率(图3)。

2.2 枝孢样枝孢霉Z20与Zt的超微形态结构比较

在透射电镜下观察到菌株Z20和Zt的超微结构无显著性差异，但存在部分区别，未见典型的梭形分生孢子(图4)。菌体的基本结构不变，均包括由细胞壁、细胞核、细胞膜以及细胞器。其中包裹在最外层的细胞壁较厚，其内侧依次为细胞膜、原生质、细胞器和胞液。与其他常规的营养菌丝相比，菌株Zt和Z20的菌丝细胞的边缘部位有较多的由嗜锇内含体所导致的大小不等的黑色颗粒状的电子密集体。

A， Zt 1 d；B， Z20 1 d；C， Zt 2 d；D， Z20 2 d；E， Zt 3 d；F， Z20 3 d；G， Zt， 4 d；H， Z20 4 d；I， Zt 5 d；J， Z20 5 d；K， Zt 6 d；L， Z20 6 d；M， Zt 7 d；N， Z20 7 d.

图2 枝孢样枝孢霉Z20(A)和Zt(B)显微镜下形态(1 000×)Fig.2 Microscopic morphology of Cladosporium cladosporioides Z20 (A) and Zt (B)

图3 枝孢样枝孢霉Zt与Z20的菌落生长曲线Fig.3 Colony growth curve of Cladosporium cladosporioides Z20 and Zt

枝孢样枝孢霉Z20和Zt在TEM下均有真菌细胞质中核糖体等基质成分流失，细胞质电子密度降低以及成分丢失所造成的空泡状。细胞质中有散在的内质网以及扩张的线粒体。细胞壁密度较高，尤其是外侧缘边界清楚，内侧边界较模糊，但可以看到细胞壁向内凹陷形成的皱褶。细胞壁内侧的细胞膜不明显，在该视野中未见细胞核，细胞质内可以看见有低电子密度的膜状物包裹或分隔形成的囊状物，可见透明大小不同的空泡。枝孢样枝孢霉Z20和Zt菌体多呈椭圆形，细胞质内线粒体等细胞器清晰，菌丝的细胞壁厚度与菌丝宽度稍有差别，Z20细胞壁厚度约为0.30 μm，菌丝宽度约为3.25 μm；Zt的细胞壁厚度约为0.15 μm，菌丝宽度约为2.50 μm。枝孢样枝孢霉野生株Z20的孢子长约1.50 μm，宽约1.00 μm，孢子内部未见丰富的细胞器。

2.3 菌丝体多糖含量测定

2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线如图5所示，在50～300 μg·mL-1范围内葡萄糖X与吸光度值Y呈良好的线性关系，所得的标准曲线回归方程式为Y=0.009 5X+0.006 5，相关系数r=0.999 5。

A，菌株Zt菌丝纵切，15 000 ×；B，菌株Zt菌丝横切，20 000 ×；C，菌株Z20菌丝纵切，15 000 ×；D，菌株Z20菌丝横切，20 000 ×；E，菌株Z20孢子，20 000 ×。A， Longitudinal of Zt mycelium, 15 000 ×; B， Crosscutting of Zt mycelium, 20 000×; C， Longitudinal of Z20 mycelium, 15 000 ×; D， Crosscutting of Z20 mycelium, 20 000 ×; E， Spores of Z20, 20 000×.

图5 葡萄糖标准曲线图Fig.5 Glucose standard curve

2.3.2 菌株Z20和Zt的菌丝体多糖含量比较

对菌株Z20和Zt的菌丝体多糖含量测定的结果表明：Z20的含量为(38.21±0.51) μg·mg-1，Zt的含量为(34.32±0.48) μg·mg-1，Z20显著(P=0.019，P<0.05)高于Zt。

2.4 药敏试验结果

枝孢样枝孢霉菌株Z20和Zt在RPMI1640培养基上生长良好，培养第6天阴性对照孔第12孔澄清透明无菌体生长，生长对照孔第11孔生长良好。其中菌株Zt结果(表1)显示：灰黄霉素MIC值为64 μg·mL-1；伊曲康唑MIC值为0.25 μg·mL-1；酮康唑MIC值为2 μg·mL-1；环吡酮胺MIC值为4 μg·mL-1；氟康唑MIC值为8 μg·mL-1。菌株Z20的结果显示：灰黄霉素MIC值为32 μg·mL-1；伊曲康唑MIC值为0.50 μg·mL-1；酮康唑MIC值为4 μg·mL-1；环吡酮胺MIC值为8 μg·mL-1；氟康唑MIC值为32 μg·mL-1。

3 讨论

3.1 枝孢样枝孢霉Z20与Zt的生长特征对比

枝孢样枝孢霉野生株Z20与突变型Zt连续培养，从菌落形态上可以发现菌株Z20的菌落颜色较Zt明显更深，Z20在显微镜下观察到的分生孢子在数量上明显高于Zt，由此可以推测菌落的颜色的深浅变化可能与孢子的数量及颜色变化相关。有研究表明色素的减少可以促使孢子的颜色变浅，使其致病力降低，在体内更容易受到巨噬细胞的吞噬和杀伤[12]。张宇[13]通过传代诱导致病力强的烟曲霉菌，获得了产孢量少、生长速度变慢、致病力明显减弱的菌株。结合前期关于菌株Z20和Zt的致病力的研究结果，菌株Zt对于小鼠的致病力明显低于Z20，可以推测突变株的分生孢子在动物体内更容易受到吞噬细胞的吞噬和杀伤，从而被机体清除 。

表1 Z20和Zt对5种抗真菌药物的最小抑菌浓度Table 1 Minimal inhibitory concentration of Z20 and Zt to 5 antifungal drugs μg·mL-1

暗色丝孢霉病是由多种条件致病性暗色丝孢霉科真菌引起的皮下组织、皮肤的炎性肉芽肿、囊肿、脓肿及系统性感染的深部真菌病，其中最重要的就包括枝孢霉属[10]。我们就枝孢样枝孢霉Z20与Zt超微结构的不同进行研究，以期明确二者之间致病性差异的问题。枝孢样枝孢霉Z20与Zt的超微结构存在一定的差异，菌株Z20的菌丝的宽度及菌丝壁的厚度均高于菌株Zt，而同一种菌丝的细胞壁的厚度稍有差别提示该菌处于不同的时期或发育阶段。真菌菌丝的有无分隔以及分隔的不同与真菌的分类标准相关，如子囊菌和半知菌的菌丝有中央孔，在本实验中均未发现明显差异。Z20与Zt在透射电镜均发现有大量的空泡及囊状物，皆是由于细胞质中核糖体等基质成分的流失所引起的细胞质中电子密度的降低，甚至于成分基本丢失而呈现出的空泡状。

3.3 菌丝体多糖含量

近年来，微生物多糖由于其广泛的应用价值，优良的性质，以及其不受地域、季节和虫害的限制等优点，已逐渐发展成具有极强市场竞争力和广阔发展前景的新兴产业[14]。菌丝体内的多糖含量不仅与其生物价值相关，更与其在环境中的适应能力相关。

由于单糖能够溶于乙醇，多糖不溶于乙醇，在提取菌株Z20和Zt的菌丝体多糖时，用85%的乙醇去除单糖以防止其对测定结果产生干扰[15]。运用硫酸-苯酚法[16-17]测定菌丝体内多糖含量，多糖在硫酸的作用下水解为单糖，单糖脱水形成醛衍生物，衍生物再与苯酚结合生成有色化合物，该化合物在485 nm处有最大吸收。此方法操作简单，灵敏度高，显色稳定，重现性好。在测定过程中所使用的空白对照需统一，做到样品的测定条件相同。加入浓硫酸的过程由于其大量的散热对结果影响较大应直接将浓硫酸加入样品而非沿壁加入导致时间难以控制，反应体现颜色差别较大标准曲线不准。通过研究我们发现，枝孢样枝孢霉Z20的菌丝体多糖含量高于菌株Zt，差异显著，表明枝孢样枝孢霉Z20与Zt相比菌丝体的多糖含量更为丰富，在环境中的适应耐受能力极有可能更强。

3.4 枝孢样枝孢霉Z20和Zt的常见药物药敏分析

暗色丝孢霉病是由暗色真菌引起的以组织中有暗色菌丝为特征的皮肤、皮下或系统性感染。但是大多数的暗色丝孢霉病对抗真菌药物不敏感，疗效欠佳[18]。本研究参照美国临床试验标准委员会(NCCLS)提出的《产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏试验参考方案》(M38-P)[19-20]进行。

通过对枝孢样枝孢霉Z20和Zt进行微量药敏试验，伊曲康唑对枝孢样枝孢霉Z20和Zt抑菌效果最好，研究表明伊曲康唑治疗口腔念珠病、马拉色菌毛囊炎等效果较好且副作用少[21-22]，且通过联合用药更有利于治疗真菌病，如与克霉唑联合治疗阴道念珠菌[23-24]，与盐酸特比萘芬联合治疗甲真菌病[25-26]，其效果均优于单一药物治疗效果。