电针预处理对换笼失眠大鼠睡眠觉醒的影响*

谢 晨,李 璐,高晓林,赵 娜,杨文佳,陈云飞△

(1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,上海 200437;2.上海市针灸经络研究所,上海 200030;3.浙江中医药大学附属第三医院,浙江 杭州 310005)

失眠是一种高流行的疾病,在工业化国家,大约有1/4的人一生中在一定程度上受到睡眠问题的干扰,10%～15%的人影响到了日间功能,6%～10%的人符合失眠的诊断标准[1]。睡眠障碍疾病国际分类第3版(ICSD3)将失眠分为慢性失眠、急性失眠和其他类型的失眠。急性失眠与首次抑郁相关,治疗急性失眠对于防止抑郁的发生意义重大[2]。早期干预急性失眠对于失眠的慢性化及向其他疾病转化意义重大。目前对于急性失眠的研究较少,换笼模型作为急性失眠模型的一种,能够反应急性失眠发生的原因。研究显示多巴胺D2受体、组胺脱羧酶基因敲除的小鼠及Dbh -/-小鼠(缺乏合成去甲肾上腺素的功能)不表现换笼失眠[3]。给予表现为急性换笼失眠的小鼠多巴胺受体拮抗剂后,换笼小鼠的急性失眠能够被改善[4]。本研究从应激相关的激素和多巴胺及其受体角度探讨电针干预急性失眠的部分机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级健康雄性SD大鼠160只,体质量(300±20)g，给予标准饲料和高压灭菌垫料饲养，均由上海市斯莱克实验动物有限责任公司动物提供，许可证号为SCXK(沪)2012-0002。大鼠饲养于实验动物中心，许可证号为SYXK(沪)2013-0109。环境温度为(24±1)℃、湿度为(60±2)%、隔音、静电屏蔽、明暗周期为12 h，以7:00和19:00为分界点，光照度≈100 lux,大鼠可以自由饮食、活动,适应性饲养1～4星期。

大鼠适应性饲养3～5天后,称重,单笼饲养,将适合条件的大鼠按照体重采用SPSS统计软件产生随机数字，并随机分为对照组、模型组、电针组和假电针组4组,每组分为换笼后0 min、30 min、2 h和6 h共4个时间点,每组每个时间点各8只。其中24只用于脑电监测。

1.2 大鼠电极埋置术

采用10%水合氯醛(360 mg/kg,ip)进行麻醉,待大鼠四肢无力后剃除大鼠头颈部体毛,将其固定于脑立体定位仪上,按文献方法[5],在大鼠头部植入脑电电极、颈部皮肤插入肌电波电极。具体步骤：75%乙醇或苯扎溴消毒手术区,手术刀片切开颅顶皮肤,剥离皮下组织后刮除骨膜,暴露颅骨,参考大鼠脑立体定位图谱,中线右侧旁开2～3 mm,前囟前2 mm和前囟后2 mm两个点以直径为0.5 mm颅骨钻钻孔,至有透破感(钻通颅骨,但未触及脑组织)后停止,安装记录脑电电极螺丝;中线左侧旁开2～3 mm,前囟前2 mm以相同钻头钻孔,不钻透颅骨,安装参考电极螺丝;后囟前后取中线左右等距离的两点以同样钻头钻孔,不钻透颅骨,安装固定电极螺丝,见图1。将颅骨上的螺丝安装好后,将用来记录肌电的两根银丝直接插入颈部肌肉。将造牙粉与义齿基托树脂凝胶Ⅱ型混合成糊状放置于颅骨上,注意修正造牙粉凝固后形状，并防止与颅骨骨膜黏连,待造牙粉凝固后缝合创口，给予青霉素腹腔注射预防感染。待动物苏醒后移入专门的睡眠生物解析系统饲养笼内恢复,恢复1周后用于实验记录,予以标准饮食和光照。

图1 大鼠脑电极、参比电极、固定螺丝安装位置

1.3 模型制备

大鼠植入电极1周后或不值入电极的各组大鼠适用性饲养1周后，置于单独的睡眠解析记录笼中，单独饲养4天后,于第5天10:00AM,将记录笼中的大鼠与本组其他记录笼中的大鼠互换记录笼,如模型组的序号为1大鼠与序号为2的大鼠交换位置，序号为2 的大鼠与序号为3的大鼠交换位置，以此类推，制备换笼失眠大鼠模型[1]。

1.4 主要仪器

脑电记录睡眠软件(sleepsign,日本Kissei Comtec);睡眠生物解析系统(Biotex Kyoto,日本);脑立体定位仪(51600,美国toelting);电钻(南韩世洋,Escort-Ⅲ);NeuroLog放大器(NL900D,日本Digitimer);台式离心机(TDL-5-A,上海安亭科学仪器厂);电针治疗仪(G6805-2,上海医疗器械高技术公司);酶标仪(352型,芬兰Labsystems Multiskan MS);恒温烘箱(DHG-9023A ,上海恒一科学仪器有限公司);石蜡切片机(SQ2125,徕克公司);显微照相系统(OLYMPUS-BX51,奥林巴斯光学工业株会社)等。

1.5 主要试剂

水合氯醛(20141011,国药集团化学试剂有限公司);义齿基托树脂凝胶Ⅱ型(140508,上海二医张江生物材料有限公司);造牙粉(140316,上海二医张江生物材料有限公司);0.9%氯化钠注射液[H20003139,华裕(无锡)制药有限公司];注射用青霉素钠(H13020655,华北制药股份有限公司);Elisa试剂盒(201512,Bioswamp);多巴胺D1受体(Ab40653,abcam);多巴胺D2受体(sc-5303,Santa cruz);广谱二抗(D-3004,上海长岛生物技术有限公司);DAB浓缩型试剂盒(FL-6001,上海长岛生物技术有限公司);苏木素(714094,BASO)等。

1.6 干预方法

假电针组：在穴位表皮给予钝性刺激,不予接电针。

电针组：使用0.16 mm×13 mm一次性针灸针,将针刺入神门、三阴交(参考林文注编著的《实验针灸学》,于每日9:00—10:00AM进行干预,接G6805-2型电针仪,连续波,10 Hz,强度以小鼠腿部轻微振动为准,电压2 V,电针15 min,电针的正负极分别接两侧神门穴及三阴交穴,每日1次,共3次。

电针组和假电针组于干预后10:00AM进行换笼。

1.7 取材

于换笼后0 min、30 min、2 h和6 h将各组大鼠麻醉后,打开腹腔,找到腹主动脉后取血。待血液凝固后离心取上清液,放于-80℃冰箱中长期保存。

脑电组大鼠脑电记录结束后打开胸腔,暴露心脏,从心尖处插入针头,剪开右心耳,注入PBS,待大鼠前肢及两肺变白后,注入多聚甲醛,至大鼠颈部变硬。取肾上腺放置于多聚甲醛中,4℃保存。大脑放置于多聚甲醛中,隔夜换30%蔗糖,4℃长期保存。

1.8 观察指标

1.8.1 血清激素水平测定 采用ELISA法测定大鼠下丘脑及血清DA、NA、EPI、CRH、ACTH、CORT。将血清从-80℃冰箱中取出，水浴箱中融化。按照试剂盒说明书分步骤进行操作，最后测量得出OD值，进一步转化为浓度。

1.8.2 脑电图记录及分析 大鼠脑电和肌点信号首先经睡眠生物解析系统处理后,与SleepSign软件(Kissei Comtec,Nagano,Japan)连接记录脑电和肌电。记录结束后,运用SleepSign分析软件,将大鼠24 h的脑电和肌电以4 s为1个分析单元,按照统一设定的标准自动扫描并判别出觉醒(wake,W)、非快速动眼睡眠(NREMS)和快速动眼睡眠(rapid eye movement sleep,REMS)。并在自动扫描完成后,进行人工校正。

以昼夜24 h为横坐标,以每个时间点每小时各时相的量为纵坐标,绘制时程曲线(time course)。时程曲线反映的是睡眠异常出现的时间。根据统计结果,标记出组间有差异的点,计算昼夜12 h/12 h的累积量,做出直方图;如数据点集中出现在某一区段,则计算这一区段的累积量,做出直方图。累计直方图反应的是昼夜12 h/12 h或是某一时间段的睡眠变化。

1.8.3 HPA轴多巴胺受体的表达 将固定的组织取出，分离下丘脑、垂体和肾上腺，将组织进行脱水、透明、包埋等处理后，依次按照免疫组化步骤操作，最后用中性树胶进行封片，烘干后在光学显微镜下观察摄片。

1.9 统计方法

采用SPSS18.0软件进行统计学处理。计量资料服从正态分布,采用均数±标准差表示,4组组间比较采用完全随机设计资料方差分析,两两比较如果满足方差齐性则采用LSD检验,如果方差不齐则采用Dunnett′s T3检验。两因素四水平的数据资料采用析因设计资料的方差分析。计量资料不服从正态分布,用M(P25,P75)表示,采用 Kruskal-Wallis H 检验分析,组间两两比较采用 Mann-Whitney U检验。检验水准为α=0.05。

2 实验结果

2.1 电针对换笼失眠大鼠睡眠觉醒量的影响

2.1.1 换笼前4组大鼠睡眠觉醒量比较 干预前4组大鼠日间睡眠觉醒量、夜间睡眠觉醒量、总的睡眠觉醒量(图2左侧3图)及各时间点的睡眠觉醒量(图2右侧3图),差异无统计学意义(P>0.05)。

2.1.2 电针治疗后4组大鼠睡眠觉醒量比较 电针减少换笼大鼠日间觉醒。模型组和假电针组表现为日间wake 时间延长(P<0.05,P<0.01),NREM 睡眠减少(P<0.05),同对照组相比差异具有统计学意义;电针组同对照组相比,睡眠觉醒量差异无统计学意义(P>0.05)。换笼后1 h、2 h、7 h，模型组和假电针组表现为明显的觉醒增加，NREM减少，同对照组相比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);电针组同对照组相比,睡眠觉醒量差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠表现为夜间2 h觉醒增加、NREM睡眠减少，同对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)，随后夜间6～11 h表现为觉醒增加、NREM睡眠减少的趋势，9 h、11 h REM睡眠增加(P<0.05或P<0.01)。见图3。

图2 换笼前4组大鼠睡眠觉醒比较(n=7～8)

图3 电针治疗后4组大鼠睡眠觉醒比较注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

2.2 电针对换笼失眠大鼠各时点外周血清激素水平的影响

2.2.1 两组大鼠各时点外周血清激素水平变化比较 2×4水平析因设计结果表明,对照组和模型组大鼠外周血激素水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),两组各时间点外周血激素水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),换笼行为和时间交互作用比较,差异无统计学意义(P>0.05),表明换笼行为对大鼠外周血6种激素水平无影响,大鼠各时间血清激素水平无差异。详见表1。

2.2.2 3组大鼠各时点外周血清激素水平变化比较 3×4水平析因设计结果表明,电针各水平即模型组、假电针组和电针组大鼠组间比较,差异无统计学意义(P>0.05),3组各时间点外周血激素水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),换笼行为和时间交互作用比较,外周血NA受到不同电针水平和时间因素的影响(P<0.05),其余差异无统计学意义(P>0.05),表明电针不同水平对大鼠外周血6种激素水平无影响,大鼠各时间血清激素水平无差异。详见表1。

2.3 4组HPA轴多巴胺受体变化比较

免疫组化阳性结果为可见棕褐色的沉积物,由于多巴胺受体为膜受体,因此,本次免疫组化的结果主要看细胞膜上的棕褐色沉积物,细胞核呈深蓝色或者深棕色。经过苏木素对比染色,非阳性的细胞则被染成蓝色。

2.3.1 4组下丘脑多巴胺受体变化比较 光学显微镜下可见：对照组大鼠下丘脑中有大量的细胞胞膜呈棕褐色细胞,见封三彩图4a、5a;模型组大鼠下丘脑中胞膜呈棕褐色细胞数量减少,见封三彩图4b、5b;电针后大鼠下丘脑中胞膜呈棕褐色细胞数量增加,见封三彩图4c、5c;假电针组大鼠下丘脑中胞膜呈棕褐色细胞数量少量增加,见封三彩图4d、5d。

2.3.2 4组垂体多巴胺受体变化比较 对照组大鼠垂体中有大量的细胞胞膜呈棕褐色细胞,见封三彩图6a、7a;模型组大鼠垂体中胞膜呈棕褐色细胞数量减少,见封三彩图6b、7b;电针干预后大鼠垂体中胞膜呈棕褐色细胞数量增加,见封三彩图6c、7c;假电针组大鼠垂体中胞膜呈棕褐色细胞数量少量增加,见封三彩图6d、7d。

2.3.3 4组肾上腺多巴胺受体变化比较 对照组大鼠肾上腺中有大量的细胞胞膜呈棕褐色细胞,见封三彩图8a、9a;模型组大鼠肾上腺中胞膜呈棕褐色细胞数量减少,见封三彩图8b、9b;电针及多巴胺受体拮抗剂干预后大鼠肾上腺中胞膜呈棕褐色细胞数量增加，见封三彩图8c、9c;假电针组大鼠肾上腺中胞膜呈棕褐色细胞数量少量增加,见封三彩图8d、9d。

表1 各组大鼠各时点外周血DA、EPI、NA、ACTH、CRH、CORT变化比较

3 讨论

失眠,中医学称为不寐,在《内经》中称为“不得卧”“目不瞑”，并提出了失眠的病机为“卫气不得入于阴,阴虚,故目不瞑”,治则为“补其不足,泻其有余,调其虚实”。《类证治裁·不寐》指出:“阳气自动而之静,则寐;阴气自静而之动,则寤;不寐者,病在阳不交阴也。”指出不寐的病机为阳盛阴衰,阴阳失交。

慢性失眠应用较多的穴位为神门、三阴交、百会和足三里等。明清时期治疗失眠穴位中出现频次较多的穴位依次是三阴交、神庭、大巨、胆俞、足窍阴、隐白、公孙和液门[6]。古代医家针灸治疗失眠多选取足太阳膀胱经穴,下肢部穴居多,特定穴多用背俞穴,使用最多的穴位为神门、三阴交[7-8]。故本次选用神门、三阴交治疗换笼失眠。神门为手少阴心经原穴,具有宁心安神之功。三阴交为足三阴经交会穴,具有调理肝、脾、肾之功,二穴合用,能够调理心肝、脾、肾的功能而发挥治疗失眠之功。

换笼失眠模型为一个生理社会应激因子,作用于睡眠的神经生物因子的模型,大鼠换笼后表现为睡眠潜伏期增加,NREM和REM睡眠下降,睡眠片段化增强,NREM中高频率的脑电活动增加[9]。本次研究发现,换笼后,同对照组大鼠相比,模型组和假电针组大鼠表现为日间觉醒,NREM量增多,提示日间睡眠减少(P<0.05),这与文献报道相一致[9]。电针组和对照组大鼠相比,无统计学差异(P>0.05),提示电针预处理能够改善换笼失眠大鼠的睡眠觉醒。而各时点的睡眠觉醒量表示，大鼠在换笼后1 h、2 h、7 h觉醒增多，NREM睡眠减少，这与文献研究的结果有差异，原因可能与大鼠睡眠觉醒监测方法不同有关，文献中大鼠睡眠觉醒是以12 s为1个单位进行监测，而本次研究采用4 s为1个单位监测。

急性失眠的病因理论3P模型认为,急性失眠与3个因素相关,3个因素分别指的是倾向、诱发和维持,倾向是生物心理社会学的范畴,是个体的心理素质,诱发因素指威胁或应激的生活事件,急性失眠与倾向和诱因相关[10],即急性失眠的发生与应激因素相关。多巴胺系统与行为过度觉醒相关[11],而下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA轴)和蓝斑-去甲肾上腺素能神经元轴(LC-NE)与应激相关[12],HPA轴分泌CORT、CRH、ACTH共3种激素,蓝斑-去甲肾上腺素能神经元轴则主要分泌EPI和NA,因此本次研究探讨了电针对应激轴的相关激素及多巴胺和HPA轴上多巴胺受体变化的影响。研究[9]认为大鼠在换笼后1～2 h表现为急性应激状态，随后3～4 h大鼠在睡眠压力的作用下睡眠觉醒无差异，而随后4～6 h表现为急性失眠的状态，小鼠的换笼行为显示换笼后30 min、2 h外周血的皮质醇均表现明显的差异[4]，故本研究选用0 min、30 min、2 h和6 h共4个时间点检测大鼠外周血激素的变化。0 min为换笼前，30 min为应激最明显时间，2 h为应激结束，而6 h为急性失眠期。

2×4水平析因设计结果表明,模型制备与否对于大鼠外周血DA、EPI、NA、CORT、ACTH、CRH无影响,模型组与对照组各时间点外周血激素水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),造模与否和时间交互作用比较,差异无统计学意义(P>0.05),表明模型对大鼠外周血6种激素水平无影响,大鼠各时间血清激素水平无差异。电针3个水平与时间4个水平的3×4水平析因设计结果表明电针的不同水平对于外周血激素水平无影响,各组不同时点的激素水平比较无差异,仅仅外周血NA受到不同电针水平和时间因素的影响(P<0.05)。上述结果可能是由于换笼行为未影响到外周血的神经递质或者急性应激状态下外周血的神经递质被机体的其他因素影响而未出现变化。以往研究表明电针“神门”“三阴交”降低血浆NE、DA、EPI以及丘脑和脑干中NE、DA含量,抑制交感-肾上腺髓质系统的过度兴奋治疗失眠[13],针刺或者电针能够抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的活性,降低慢性应激焦虑大鼠血浆CORT含量[14]。电针降低慢性应激模型大鼠垂体ACTH、肾上腺CORT的分泌,可能通过调整垂体ACTH和肾上腺CORT的过度分泌,进而纠正HPA轴亢进[15]。电针可显著降低焦虑大鼠下丘脑室旁核CRH和CRHR1mRNA表达[16]。电针神门、三阴交降低心理应激失眠大鼠其脑组织Ach、CRH和血浆ACTH、CORT进而调节失眠大鼠HPAA的兴奋[17]。本次研究结果与之不同的主要原因为当前研究选用慢性应激焦虑大鼠模型,模型制作的方法不同,造模时间不同。

动物研究认为,多巴胺在觉醒和REM睡眠时增高,NREM时降低。多巴胺受体激动剂增加觉醒,拮抗剂增加睡眠。D1受体激动剂增加觉醒,减少REM睡眠[18];D2受体激动剂对睡眠觉醒的作用为双向的,低剂量减少觉醒,增加NREM和REM睡眠,高剂量表现相反[19]。D1受体拮抗剂增加总的睡眠和REM睡眠是区别于其他多巴胺受体拮抗剂的一个特征[20]。D2受体拮抗剂总的增加睡眠,但也与剂量相关[21]。最新的研究表明,D2受体基因敲除的小鼠表现为夜间觉醒减少,NREM和REM增加[22],多巴胺转运体蛋白基因敲除小鼠(DAT-KO mice)表现为一个新的觉醒状态[23]。上述研究均表明,多巴胺受体与睡眠觉醒密切相关。本次研究发现换笼后24 h模型组大鼠HPA轴的D1和D2受体表达水平显著降低,而电针干预后HPA轴的D1和D2受体表达水平升高。说明电针可能通过调节HPA轴D1和D2受体表达水平干预急性失眠。

本研究采用电针预处理换笼失眠大鼠,为临床治疗急性失眠提供实验室依据,探讨电针干预换笼失眠的多巴胺及其受体机制,为研究急性失眠提供了一定的研究基础,便于电针治疗急性失眠在临床应用。未来将从中枢DA、EPI、NA、CORT、ACTH、CRH水平及DA受体的蛋白和mRNA水平共同探讨电针干预换床失眠的机制,同时给予多巴胺相关的激动剂和拮抗剂,深入探讨电针的作用机制。