草莓蔗糖转运基因FaSUT5对“申阳”草莓果实糖分积累的影响

吕文远,张 玲,王延秀,高清华,段 可**

(1.上海海洋大学 水产与生命学院,上海 201306;2.上海市农业科学院 林木果树研究所,上海 201403;3.甘肃农业大学 园艺学院,甘肃 兰州 730070)

草莓在我国的浆果植物种植中占有十分大的比例,为了提高草莓的风味和品质,研究人员从未间断对草莓果实糖分相关因素的探索。糖不仅仅是果实甜度的指标,还是酸、色素、芳香物质及其他营养成分的基础原料[1]。草莓果实糖分积累以蔗糖、葡萄糖和果糖为主,其中蔗糖的积累主要来源于叶片光合产物的长距离运输[2]；蔗糖运输是由植物组织韧皮部中的筛管分子和伴胞共同作用完成的,而蔗糖跨膜转运则需要膜上的蔗糖转运蛋白(sucrose transporters, SUTs)的协助[3],因此草莓果实中的糖分调控因子蔗糖转运蛋白在植物的生长代谢过程中起到了至关重要的作用。1992年Riesmeier等学者首次从菠菜中分离出SUT基因,自此科学家们对SUT相关功能的研究越来越深入。蔗糖转运蛋白StSUT1定位于马铃薯块茎的韧皮部[4]；马铃薯中的StSUT1在成熟叶片中高表达,在茎和发育叶片中的表达量较低[5]。番茄中的LeSUT1主要在韧皮部细胞中表达[6],这对蔗糖积累运输起到了至关重要的作用；LeSUT2主要存在于库器官中[7]；LeSUT4主要在子房和未成熟的果实中表达[8]。王利芬等发现白梨中的蔗糖转运基因PbSUT2在番茄中过量表达,同样可以提高番茄中蔗糖的积累量[9]。拟南芥中包含AtSUT1～AtSUT9共9个基因，它们在拟南芥中各个部位具有不同的表达量,发挥着不同的作用[10]。AtSUT1对于拟南芥花粉萌发以及蔗糖诱导花青素的积累具有十分重要的作用[11]；拟南芥中的蔗糖转运蛋白AtSUT2相较于其他蔗糖转运蛋白亲和力较低[12]；AtSUT5与拟南芥种子的成熟具有十分密切的联系,在拟南芥花后4～9 d的种子发育阶段高度表达[13]。AtSUT9与拟南芥中的其他蔗糖转运蛋白相比,对蔗糖具有极高的亲和力,AtSUT9遍布于拟南芥的花和茎中,对拟南芥的花期也具有明显的调节作用[14]。Frost等[15]在杨树中发现PtaSUT4可参与植株水分调控，对植物响应水分胁迫具有明显的作用。MdSUT4主要分布在苹果的叶、花及幼果中,许海峰等得出结论：MdSUT4可能与蔗糖从液泡膜中的外排有关,并且有可能促进类黄酮的合成[16]。Berthier 等[17]在黑麦中发现LpSUT2基因对植株落叶具有一定的影响。ZmSUT2能够促进玉米生长发育过程中对蔗糖的利用,并且能够大幅度地提高玉米的产量[18]。而TaSUT1A的过量表达可以大大提高小麦的耐旱性[19]。目前,对SUTs基因的研究已取得了较大的进展,但对SUT5基因的研究较少。

植物通过光合作用产生的蔗糖,一小部分用于自身代谢,其余大部分经过韧皮部长距离运输，最后到达库组织[20]；另外,蔗糖还具有一定的信号调节功能,植物体内的蔗糖在促进一些基因表达的同时也会遏制另一些基因的表达[21-22]。草莓果实的品质是由果实中的糖分和酸共同调控决定的,因此草莓果实中的有机酸含量对草莓果实品质的影响也十分重要,栽培草莓果实的可溶性有机酸主要为柠檬酸[23]和苹果酸。本研究通过对“申阳”草莓果实中的蔗糖、果糖、葡萄糖以及柠檬酸和苹果酸含量的测定，探究了FaSUT5基因过表达对草莓果实中可溶性糖以及有机酸含量的影响。

1 材料与方法

1.1 植物材料及试剂

本研究以2016年10月种植于上海市农业科学院庄行试验站塑料大棚中生长良好的草莓品种“申阳”(Fragaria × ananassa Duchesne Shenyang, ‘SY’)为试验材料,选取胚发育一致的横径为18～20 mm的草莓大绿果,分别注射过表达载体35s: SUT5(pCAMBIA1300)或空载体35s: (pCAMBIA1300)的农杆菌菌株,共2个处理，每个处理30个果实。

供试35s: (pCAMBIA1300)载体质粒、大肠杆菌DH5α (Escherichiacoli)与农杆菌GV3101 (Agrobacterium)被保存于上海市农业科学院林木果树研究所生物技术课题组。

MLV反转录酶、RNase Inhibitor购自Promega公司；T4-DNA连接酶购自Fermentas公司；限制性内切酶SacI、SalI等购于上海诺宁生物科技有限公司；质粒小抽试剂盒、DNA纯化试剂盒购于Axygen公司；pUCm-T载体、Amp、Gen、Kan等购自上海生工公司；植物RNA提取试剂盒购于北京原平皓生物公司；SYBR GreenⅠ荧光染料、反转录试剂盒购于TaKaRa公司；其他化学药品均购于国药集团。引物由上海生工生物工程有限公司合成。RT全长引物及内参参照张玲等[23]的方法进行设计。

1.2 试验方法

1.2.1 基因克隆 以‘SY’为材料,利用同源克隆技术克隆FaSUT5全长基因和FaSUT5保守序列。根据GDR数据库中已登录的栽培草莓FaSUT5全长基因信息,设计FaSUT5全长引物及FaSUT5保守区域引物,以‘SY’草莓的cDNA为模板进行PCR扩增,将得到的符合预期目标大小的FaSUT5全长基因经T4-DNA连接酶连接到pUCm-T载体上,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中过夜培养。经菌落PCR、质粒PCR及质粒酶切鉴定后均得到符合预期大小的目标条带后,送阳性克隆至北京六合华大基因科技股份有限公司(上海)测序。

1.2.2FaSUT5过表达载体构建 采用SacI和SalI双酶切体系消化FaSUT5正向插入pUCm-T载体的单克隆质粒,纯化回收FaSUT5全长基因后定向插入用相同限制性内切酶处理的表达载体35s: (pCAMBIA1300),转化大肠杆菌感受态细胞。挑取单克隆，经菌液PCR、质粒PCR与质粒酶切鉴定后,挑选阳性克隆测序。将测序鉴定FaSUT5过表达载体35s:FaSUT5(pCAMBIA1300)构建成功的质粒采用冻融法转入根癌农杆菌GV3101感受态细胞,2 d后挑取单克隆进行菌液PCR鉴定,保存阳性克隆用于草莓果实侵染试验。

1.2.3 农杆菌侵染草莓果实试验 使用无菌牙签在LB平板上分别挑取含有过表达载体35s:SUT5(pCAMBIA1300)或空载体35s:(pCAMBIA1300)的农杆菌菌株,接种于5 mL YEP培养基(含有50 μg/mL Kan、50 μg/mL Rif和50 μg/mL Gen)中,在28 ℃下以250 r/min培养过夜；次日从中吸取500 μL菌液接种于50 mL YEP培养基(含有10 mmol/L MES、20 μmol/L AS、50 μg/mL Kan、50 μg/mL Rif和50 μg/mL Gen)中,于28 ℃下过夜培养,摇菌至对数期(OD值为0.6～0.8),以4000 r/min离心10 min收集菌体。用侵染缓冲液(含有10 mmol/L MES、200 μmol/L AS、10 mmol/L MgCl2)重悬菌体,并调节菌液浓度至OD值为1.2～1.5,于28 ℃静置3 h后，利用无菌注射器从果实蒂部注射200 μL菌液到草莓果实中,每天观察果实的表形变化。

1.2.4FaSUT5表达分析 利用半定量RT-PCR分析FaSUT5在各生长时期处理样品中的表达情况。以草莓的延伸因子FaEF1α为内参基因,半定量反应体系为2×Taq Master Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNAs 2 μL,加水至终体积20 μL,充分混匀。用PCR仪进行PCR扩增,对所得产物进行凝胶电泳,对结果进行分析。

利用荧光定量PCR分析FaSUT5在过表达样品中的表达情况,以草莓的延伸因子FaEF1α为内参基因,定量反应体系为2×SYBR Premix DmerEraser 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNAs 2 μL,加水至终体积20 μL,充分混匀。用LightCycler 480实时定量PCR仪进行PCR扩增,对所得数据进行分析。

1.2.5 果实可溶性糖和有机酸含量的测定 参照张玲等[25]的方法(本文略有改动)进行测定。

2 结果与分析

2.1 FaSUT5过量表达分析结果

通过实时定量RT-PCR分析草莓果实中FaSUT5 的表达,结果如图1所示。与空载体注射相比较,注射了过表达载体的草莓果实中FaSUT5基因的相对表达量更高,说明SUT5对草莓果实糖分的积累具有明显的调节作用。

Blank1、Blank2为注射空载体的草莓果实(对照); OE1、OE2、OE3分别为注射过表达载体的草莓果实。图1 草莓果实中FaSUT5表达的实时定量RT-PCR分析结果

2.2 FaSUT5表达对草莓果实中糖含量的影响

经高效液相色谱(HPLC)分析[26-28],FaSUT5表达对草莓果实含糖量的影响如图2所示。由图2可见，注射了过表达载体的草莓果实中的蔗糖含量明显高于注射了空载体的,而葡萄糖和果糖的含量在两者间没有明显的差异。说明FaSUT5的表达可以明显增加草莓果实中蔗糖的含量。

Blank1、Blank2为注射了空载体的草莓果实(对照);OE1、OE2、OE3分别为注射了过表达载体的草莓果实。差异显著性分析在P<0.01水平下进行。下同。

图2FaSUT5基因过表达对草莓果实中可溶性糖含量的影响

2.3 FaSUT5表达对草莓果实中酸含量的影响

FaSUT5对草莓果实中有机酸含量的影响如图3所示。与对照相比，试验组草莓果实中柠檬酸含量明显减少,苹果酸含量也有变化。说明FaSUT5的表达可以有效减少草莓果实中有机酸的积累。

3 小结与讨论

植物中的SUTs基因对植物的生长发育有着极为重要的影响,并且不同的SUT基因作用于植物生长发育的不同阶段。本研究证明了FaSUT5在申阳草莓果实的生长发育过程中,对蔗糖含量具有明显的正向调控作用,并且可以降低草莓果实中主要有机酸的含量。这为通过糖酸比来改善草莓果实的品质提供了理论依据，为SUTs家族其他相关基因的研究奠定了良好的基础。本研究结果也与前人在其他作物上的研究结果[29-30]相吻合。

图3 FaSUT5基因过表达对草莓果实中有机酸含量的影响