ORF1编码的四种非结构蛋白可用于戊型肝炎病毒的基因分型

胡玲玲，王跃荣，郑海音

（上海中医药大学附属市中医医院检验科，上海 200071）

0 引言

戊型肝炎病毒（hepatitus E virus，HEV）是病毒性戊型肝炎的病原体，以感染青壮年为主，在中国内陆、墨西哥和东南亚地区等均发生过暴发流行，近年来，在发达国家戊型肝炎的流行增多[1]。孕妇患病率较高，且病情严重，容易导致流产、死胎等[2]。

HEV基因组全长约7.5kb，包括5ˊ非编码区、3ˊ非编码区和3个开放阅读框（Openreadingframe,ORF）[3]。ORF1基因长度约为5082bp，编码五种非结构蛋白：甲基转移酶(methyltransferase)、多聚脯氨酸铰链(poly-prolinehinge)、 解 旋 酶 (helicase)、木瓜样半胱氨酸蛋白酶(papain-like protease)和RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase)。ORF1不仅与病毒的复制有关，而且还在病毒的培养、病毒适应及致病性等发挥作用。

HEV的不同基因型在致病性方面存在差异，感染后的临床症状和病程结局也有所不同。核酸序列分析表明，目前能感染人类的HEV有4个基因型，分型的依据是全基因序列的核苷酸同源性，因此结果最为准确。但全基因测序历时长耗费大，序列比对也比较困难，我们之前的研究[4]发现ORF1编码的甲基转移酶可作为HEV的分型依据，甲基转移酶是HEV的ORF1所编码的五个非结构蛋白之一，本研究选取ORF1编码的其他的四个非结构蛋白来探讨其是否可以用于HEV的基因分型，报道如下。

1 材料与方法

1.1 HEV参考株

Chi-XJ1株（NC_001434）为基因型4型，是GenBank中测序最全且比较准确的。基因2型只有墨西哥分离株(MEX-14)的全基因序列收录在GenBank中，在此没有列入研究，主要对基因1、3和4型进行探讨。

1.2 多序列比对和系统进化分析

从 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov） 的GenBank中获取了35株HEV病毒株，其基因组是测序完整的且能感染人类，包括12个1型病毒株，9个3型病毒株，14个4型病毒株。我们将这35株HEV全序列以及编码蛋白质的基因片段采用Clustal W程序进行多序列比对，用treev32绘制基因进化树，研究其进化关系。

2 结果

2.1 预测HEV的蛋白表达图谱

在GenBank中仅可以下载到Chi-XJ1株(NC_001434)的主要蛋白质木瓜样半胱氨酸蛋白酶、多聚脯氨酸铰链、解旋酶和RNA依赖的RNA聚合酶的编码序列，我们用Clustal W将Chi-XJ1株编码这四种蛋白质的完整的编码序列与其他各株HEV基因组进行了比对，预测出其他GenBank中没有给出的各株HEV的四种主要蛋白编码区。

2.2 ORF1编码的四种非结构蛋白的基因序列可用于HEV的基因分型

将通过以上方法所得到的四种非结构蛋白的基因序列用Clustal W进行比对，并用treev32进行进化分析，发现编码木瓜样半胱氨酸蛋白酶、多聚脯氨酸铰链、解旋酶和RNA依赖的RNA聚合酶这四种非结构蛋白的多序列比对均将这35株HEV正确的分成了3个基因型，且每株病毒都被正确的归类到了自己的基因型中，与GenBank中的报道是一致的。所以我们有理由可以把木瓜样半胱氨酸蛋白酶、多聚脯氨酸铰链、解旋酶和RNA依赖的RNA聚合酶这四种非结构蛋白作为HEV的分型依据，结果见图1-图4。

图1 35株HEV木瓜样半胱氨酸蛋白酶基因序列的进化树分析

图2 35株HEV多聚脯氨酸铰链基因序列的进化树分析

图3 35株HEV解旋酶基因序列的进化树分析

图4 35株HEV的RNA依赖的RNA聚合酶基因序列的进化树分析

3 讨论

戊型病毒性肝炎是由HEV引起的肝脏病变，既可以引起临床散发病例，也可以导致大规模的暴发流行。虽然目前尚未发现特异性针对戊型肝炎的治疗药物，但临床上需根据戊肝患者的临床类型、病情轻重及并发症区别对待。

HEV感染的患者病毒RNA可较早的在粪便或血清中发现，但两到四周后血清中才出现特异性IgM抗体，而特异性的IgG抗体出现较晚且长期持续存在，其中IgM抗体可作为HEV急性感染的标志。戊型肝炎的实验室诊断主要包括RT-PCR检测血清中HEV核酸，免疫电镜法检测粪便中HEV病毒颗粒，酶联免疫检测法检测血清中抗HEV IgM和IgG抗体。核酸检测是戊型肝炎诊断的金标准；电镜法对仪器设备以及人员要求较高，应用受到限制；酶联免疫检测法可以对HEV定性检测，成本较低，且灵敏度和特异度也较高，目前应用较为广泛，但是不同检测试剂的检测结果时常有出现不一致的情况[1]，原因可能是重组抗原不能正确折叠，或HEV不同的基因型在非免疫优势表位间存在差异。

一般认为HEV感染是急性自限性疾病，但2008年Kamar等[5]首先发现8例器官移植的患者发生了HEV慢性持续性感染，检测其基因型为3型，另一项回顾性研究发现感染了HEV的患者进行器官移植60%以上进展成了慢性戊型肝炎[6]。

戊肝患者发病的严重性及预后与HEV的基因类型密切相关[7-9]，研究发现我国新疆、尼泊尔等地区孕妇感染1型HEV后病死率高达20%。有些伴有其他肝病的患者若同时感染4型HEV后，可引起迅速的肝纤维化、肝硬化或急性肝衰竭等症状。目前人体内检测出的HEV有4种基因型[10]，基因1型和2型引起的HEV感染主要引起戊肝的爆发流行，且多是急性自限性。基因3型和4型HEV为人畜共患病原体，主要引起散发病例，近些年的发病呈上升趋势。因此对于高流行地区的一些特殊人群采取有效的预防措施是必要的[11]。HEV的研究日渐深入，疫苗的研制也日趋成熟[12-13]，有望降低戊肝的发病率和死亡率。

随着基因测序技术的快速发展，HEV分型是进行全基因或部分基因的测序，但全基因序列较长，可以尝试选取较短的基因序列替代全基因组序列进行比对。ORF1可以编码五种与病毒复制相关的非结构蛋白，其基因编码序列都比全基因组序列短，且我们之前研究[4]已发现甲基转移酶的基因序列可以代替全基因序列对HEV进行分型，如果其他四个ORF1编码的非结构蛋白其编码序列可以发挥同样的作用，那么可以为HEV的分型提供更多、更简便快捷的方法。

我们从GenBank中获取了35株HEV病毒株，其基因组是测序完整的且能感染人类，包括12个1型病毒株，9个3型病毒株，14个4型病毒株。Chi-XJ1株（NC_001434）是GenBank中信息最全且比较准确的，以它为参照，明确的预测出ORF1编码的四种非结构蛋白的基因序列，将这35株HEV的木瓜样半胱氨酸蛋白酶、解旋酶、多聚脯氨酸铰链和RNA依赖的RNA聚合酶基因序列分别用Clustal W进行多序列比对，并用treev32绘制进化树，描述各病毒株之间的亲缘关系，发现结果与GenBank中的报道是一致的，皆可以分为1型、3型和4型，与我们之前的研究[4]中HEV全基因组的多序列比对的进化树结果一致，虽然各型内的进化关系稍有不同。但与HEV基因组全长相比，我们选取的片段具有更大的优势，其中RNA依赖的RNA聚合酶只有1460bp；其他的基因序列则更短，木瓜样半胱氨酸蛋白酶为479bp、解旋酶为734bp，多聚脯氨酸铰链只有200bp。

综上所述，通过本研究发现，只需设计合适的引物扩增出ORF1编码的四种非结构蛋白木瓜样半胱氨酸蛋白酶、RNA依赖的RNA聚合酶、解旋酶和多聚脯氨酸铰链其中一个的基因序列，再将PCR产物测序并做进化树分析即可简便、快速的对HEV进行基因分型。