宫颈细胞DNA倍体异常伴ASCUS病变的临床病理学意义

纪捷，张静敏，程雪，李华，伍凤平

（1南京市妇幼保健院病理科，南京210004；2武汉兰丁云医学检验实验室，武汉430206）

宫颈癌是由高危型HPV持续感染所致。HPV将其DNA片段整合到宫颈细胞核内DNA上，可引起染色体数量改变形成非整倍体细胞[1-3]。非整倍体细胞早期没有形态上的改变，随着病变发展，逐渐演变成宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），最终导致宫颈癌[4-6]。宫颈细胞学按Bethsda报告系统（The Bethesda System, TBS）为诊断标准。具体分为正常、意义未明的不典型鳞状细胞（atypical squamous cells of undermined significance，ASCUS）、非典型鳞状细胞不除外高级别鳞状上皮内病变（atypical squamous cells, cannot exclude highgrade squamous intraepithelial lesion, ASC-H）、低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL）和高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL），病理诊断分为：慢性炎症、宫颈上皮内瘤变1级（CIN1）、CIN2、CIN3和宫颈癌。其中，LSIL相当于CIN1，HSIL相当于CIN2、CIN3和癌。

宫颈细胞DNA定量分析主要测定宫颈细胞DNA倍体是否异常，CIN或宫颈癌中宫颈细胞多有DNA非整倍体改变[7-9]。本文试图通过研究ASCUS伴有DNA倍体异常的患者的病理改变，判别宫颈癌及癌前病变严重程度及发展趋势。

资料与方法

1 标本来源

2016年10月至2017年7月，对南京市妇幼保健院33188名妇女，年龄范围为21～73岁，平均年龄（41±8）岁，行宫颈细胞学检查，按常规方法进行宫颈细胞学取材。采用于液基薄层制片，试剂盒由武汉兰丁医学高科技有限公司提供。每个样本制成二张液基薄层玻片，一张用巴氏染料染色供常规细胞学诊断，另一张用Feulgen染料染色供DNA倍体测定。

2 常规细胞学诊断

常规细胞学诊断标准按TBS诊断系统进行，诊断分别为正常、ASCUS、ASC-H、LSIL和HSIL。

3 DNA图像分析仪行DNA倍体分析

所有Feulgen染色片采用兰丁全自动细胞图像分析系统进行扫描处理（武汉兰丁医学高科技有限公司），其符合欧洲定量细胞病理学会DNA定量分析图像系统的各项标准[10]。诊断标准及操作过程按标准程序进行[11]。该系统对每张玻片上1000个以上的细胞核进行扫描测定。经扫描后的每个细胞核均有500个特征值，其中包括形态特征、吸光特征、具体结构特征、Markovian和非Markovian结构特征和长度特征等。系统根据不同细胞成分所具有的不同特征参数来完成自动细胞分类和计数过程。标准对照细胞为同张玻片上的100个正常上皮细胞，所测出的积和光密度（integrated optical density, IOD）为2c的参考值，其变异系数（coefficient of variation,CV）值小于5%。凡是有＞5c以上非整倍体细胞的玻片，均由细胞技术员在显微镜下逐一对大于5c细胞进行核实，以排除该系统将垃圾和重叠的细胞核误认为异常细胞。凡发现3个或3个以上大于5c的异倍体细胞或发现异倍体峰，即诊断为阳性，其余诊断为阴性。

4 阴道镜及病理学检查

宫颈常规细胞学诊断ASCUS及以上级别者或DNA定量分析异常者，行阴道镜的检查并对宫颈可疑部位进行4个点以上的组织活检，其中76例细胞学和DNA倍体诊断为正常，而阴道镜下诊断为可疑，从而行组织学活检。每例活检样本由有经验的病理学医生出病理诊断报告。病理诊断报告分为正常、宫颈炎、CIN1、CIN2、CIN3或原位癌及浸润癌。

5 统计学处理

常规细胞学诊断分为正常、ASCUS、ASC-H、LSIL和HSIL 5个级别。将每个级别分成2组，即DNA倍体正常和异常2组。比较不同级别2组之间在诊断CIN2、CIN3和宫颈浸润癌例数的百分比的不同。采用配对χ2比较，运用SPSS 13.0软件进行处理，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 539例宫颈病理活检情况

539位妇女进行宫颈组织学活检。活检组织病理学诊断为372例宫颈炎、145例CIN1、71例CIN2、46例CIN3和5例浸润癌。在539例活检病例中，常规细胞诊断为173例正常，251例ASCUS，30例ASC-H，48例LSIL和37例HSIL。DNA倍体分析发现539例中，DNA倍体异常278例，正常为261例。

2 ASCUS病例伴有DNA倍体异常者患CIN2及CIN2以上级别病例数增多

在常规细胞诊断为ASCUS的251例宫颈样本中，无非整倍体细胞168例中发现8例CIN2的病变（4.7%），而有非整倍体细胞的83例中发现17例CIN2或CIN2以上级别的病变（20.5%），这二组的百分比之间用配对χ2检验（χ2=6.69，P=0.023），有显著性差异。常规细胞学诊断30例ASC-H中，9例无非整倍体细胞中有2例病理诊断为CIN2（22%），而21例伴有非整倍体细胞病例中有19例为CIN2或CIN2以上级别的改变（90.4%），二组之间配对χ2检验有显著性差异（χ2=11.41，P=0.009）。在48例常规细胞学诊断为LSIL病例中，8例无非整倍体细胞中仅有2例为CIN2病变（25%），而40例有非整倍体细胞中有20例CIN2或CIN2以上级别病变（50%），二组之间配对χ2检验无显著性差异（χ2=0.365，P=1之间）。在37例常规细胞诊断为HSIL病例中均伴有非整倍体细胞，其中31例病理诊断为CIN2或CIN2以上级别的病变（83.7%）（表1）。图1-图3显示一例宫颈细胞诊断为ASCUS伴有DNA倍体异常，组织病理诊断为CIN2。在111例CIN2或CIN2以上级别病例中，有96例（86.5%）宫颈细胞发现非整倍体，15例（13.5%）宫颈细胞内无非整倍体（表1）。

表1 539例宫颈活检病例常规细胞学各级诊断中整倍体组与非整倍体组之间的差别Tab. 1 Difference between diploid and aneuploid groups in 539 cervical biopsies

图1 宫颈细胞常规诊断为ASCUS。比例尺，25μmFig.1 ASCUS diagnosed by conventional cytology. Scale bar, 25μm

图2 DNA倍体诊断发现大量＞5c的的异倍体细胞Fig. 2 DNA ploidy diagnosis detected aneuploid cells (＞5c)

图3 宫颈组织活检病理组织诊断为CIN2。比例尺，100μmFig. 3 Cervical tissue biopsy and pathological diagnosis of CIN2. Scale bar, 100μm

讨 论

1 ASCUS病例伴有DNA倍体异常者发展为CIN2或CIN2以上级别的风险较大

在宫颈TBS诊断系统中，常可见ASCUS病例，ASCUS病例如何处理是临床上常见的问题。目前，临床上如发现ASCUS病例，常要求做HPV-DNA病毒测定。如果高危型HPV病毒检测阳性，说明有HPV病毒存在，病变有潜在发展趋势，要求患者进一步做阴道镜和组织活检；如果高危型HPV病毒阴性，则不需要进一步处理。

本研究ASCUS或ASC-H病例伴有宫颈细胞非整倍体病例中，活检证实分别有20%和90%病例为CIN2或CIN2以上级别的病变；而没有非整倍体细胞者，分别只有4.7%和22%病例为CIN2或CIN2以上级别的病变。有报道证实，无非整倍体细胞的ASCUS、LSIL患者的阴性预测值为95%，而具有非整倍体细胞的ASCUS、LSIL患者2个月后发展为CIN3或宫颈癌的阳性预测值为46%，而3年后100%发展为宫颈癌，其阳性预测值为100%[10]。因此建议，ASCUS无非整倍体细胞者，可进行定期随访，无需活检，而ASCUS伴有非整倍体者要求活检。ASC-H病例伴有非整倍体细胞者病变较无非整倍体细胞者严重。这些结果均表示DNA倍体分析结合TBS诊断可用于判别病变的严重程度和发展趋势。

2 细胞学诊断为ASC-H、LSIL、HSIL病例或病理诊断为CIN2或以上病例多伴有DNA倍体异常

DNA倍体分析用于宫颈细胞检查已在国内外均有报道。在细胞学诊断为ASC-H、LSIL、HSIL和病理诊断为CIN2或CIN2以上患者，宫颈细胞多有DNA非整倍体。本研究的结果与这些报道一致[10,11]，即在TBS诊断为ASC-H、LSIL或HSIL病例分别有90.4%、50%和83.7%的病例细胞中有DNA倍体异常，在111例病理活检证实为CIN2、CIN3或浸润癌病例中有15例（13.5%）无非整倍体细胞，96例（86.5%）均可见非整倍体宫颈细胞。为什么宫颈癌或宫颈癌前病变的宫颈细胞核内DNA倍体会改变呢？HPV病毒感染可通过病毒E6或E7蛋白影响pRb或p53通道，而引起被感染细胞核内染色体倍体改变，最终可致宫颈癌前病变和浸润癌。这些均表明HPV病毒可引起宫颈细胞核内染色体倍体异常。

总之，DNA倍体异常是细胞内肿瘤改变的重要标记之一。ASCUS病例伴有DNA倍体异常者，发生CIN2或CIN2以上级别的可能性高。