孕酮膜受体在小鼠生殖系统的分布与表达

林翠英，林杨元，张趁华，刘黎星，王守安

(莆田学院基础医学部，莆田，351100)

在雌性哺乳动物的生殖活动中，孕酮是一种十分重要的性激素，也是早胚发育的关键因素。孕酮膜受体(membrane progestin receptors, mPRs)能使孕酮产生快速非基因组效应。它们属于类孕激素和脂联素分子受体(progestin and adipoQ receptors，PAQRs)家族，存在于细胞膜上，通过调节膜腺苷酸环化酶的活性引起细胞内 cAMP 的水平变化，而产生相应的效应[1,2]。本研究通过检测mPRs在小鼠子宫、输卵管和卵巢的定位及表达，为进一步探讨其在早胚发育中的作用提供实验依据。

材料和方法

1 实验动物和材料

昆明雌鼠(6～8w) 购自吴氏实验动物研究中心，饲养3～5d，调节生理周期，使其适应环境。抗小鼠mPRs多克隆抗体(Santa Cruz)；S-P超敏试剂盒KIT-9701内含A液B液C液D液(迈新试剂公司)；免疫组织化学摄像系统(Olympus)。TRIZOL试剂、无RNA酶的糖原、SuperScriptTM III reverse transcriptase、5× RT 缓冲液（Invitrogen Life Technologies），RNA酶抑制剂（Epicentre），2.5mmol/L dNTP混合液（dATP，dGTP，dCTP和 dTTP各 2.5mmol/L）（HyTest Ltd），2× PCR master mix（Arraystar），Gene Amp PCR System 9700（Applied Biosystems），Primer（英骏生物技术有限公司），QuantStudio™ 5 System (Applied Biosystems)，Gene Amp PCR System 9700（Applied Biosystems）。

2 免疫组织化学检测mPRα、mPRβ和mPRγ 蛋白质表达

取6～8w昆明雌鼠以颈椎脱臼法处死小鼠，迅速取出子宫、输卵管和卵巢，置于10%中性缓冲福尔马林中固定过夜，常规脱水、石蜡包埋，制成5μm 厚切片。烤好切片常规脱蜡入水，柠檬酸抗原修复：A液10min、B液15min，4℃一抗过夜，C液10min、D液10min，DAB显色8min，苏木素复染7min，脱水、吹干封片。对照采用PBS 取代一抗，其余步骤同上。

3 实时定量PCR分析mPRα、mPRβ和mPRγ的mRNA表达

取6～8w昆明雌鼠阴道涂片区分动情期和动情间期，以颈椎脱臼法处死小鼠，迅速取出子宫、输卵管和卵巢，TRIzol 法提取总RNA，进行逆转录合成cDNA，实时定量PCR 分析分析mPRα、mPRβ和mPRγ的mRNA表 达， 并 以ACTB(-MOUSE) 基因为内参照。引物序列如下：ACTB(247bp) ，F-5’ GTACCACCATGTACCCAGGC3’，R-5’ AACGCAGCTCAGTAACAGTCC3’；mPRα(226bp)，F-5’GCACCGCATCATAGTGTCTCC3’，R-5’ ATAATCCAGTGTCACCGCCTCT3’； mPRβ(277bp) ，F-5’TCTATGGAACACTACAGACGCT3’，R-5’ AAGAAGTAGTAACGCCACTCG3’ ；mPRγ(174bp)，F-5’ GGACTATGGTGCCGTCAATC3’，R-5’ TGGAGTTCAAGAAACCTGGAGTA3’。分别进行实时定量 PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，生成各样品目的基因和管家基因的浓度，进行校正定量计算结果。

4 统计学处理

用SPSS 19.0 统计软件对实时定量PCR结果数据进行统计分析，运用t 检验进行组间比较。

结 果

1 mPRα、mPRβ和mPRγ在子宫、输卵管和卵巢的定位表达

图1 小鼠子宫中mPRs 免疫组织化学表达。A，阴性对照组；B，mPRα；C，mPRβ；D，mPRγ；比例尺，100μmFig. 1 Evaluate mPRs expression in mouse uterus using immunohistochemitry. A, control; B, mPRα; C, mPRβ; D, mPRγ; scale bar, 100μm

免疫组织化学染色显示，免疫反应阳性产物呈棕黄色，阳性细胞易于识别，阴性对照呈阴性反应（图1A和图2A）。在小鼠子宫内，mPRα（图1B）和mPRβ（图1C）免疫阳性反应分布于内膜上皮、腺体上皮和内膜基质和血管内皮，而mPRγ(图1D)弱阳性反应见于腺体上皮和血管内皮，其他结构几乎不着色；在卵巢中，mPRα（图2B）和mPRβ（图2C）免疫阳性反应见于卵巢间质，弱免疫阳性反应见于卵母细胞和颗粒细胞，mPRγ未见明显免疫阳性反应（图2D）；在输卵管中，三种蛋白均未见明显免疫阳性反应。

图2 小鼠卵巢中mPRs 免疫组织化学表达。A，PBS阴性对照组；B，mPRα；C，mPRβ；D，mPRγ；比例尺，100μmFig. 2 Evaluate mPRs expression in mouse ovary using immunohistochemitry. A, PBS control; B, mPRα; C, mPRβ; D, mPRγ; scale bar, 100μm

2 mPRα、mPRβ和mPRγ mRNA在子宫、输卵管和卵巢的表达

实时定量PCR检测显示，在子宫、输卵管和卵巢中，mPRα、mPRβ和mPRγ的mRNA均有表达，mPRβ mRNA表达水平高于mPRα和mPRγ mRNA。对比，3种组织内mPRα、mPRβ和mPRγ mRNA表达水平在动情期和动情间期之间无显著差异（图3-图5）。

图3 小鼠子宫中mPRα、mPRβ和mPRγ mRNA表达水平比较。*，P＜0.01Fig. 3 mRNA expression levels of mPRα, mPRβ and mPRγ in mouse uterus, *, P＜0.01

图4 小鼠卵巢中mPRα、mPRβ和mPRγ mRNA表达水平比较。*，P＜0.01Fig. 4 mRNA expression levels of mPRα, mPRβ and mPRγ in mouse ovary, *, P＜0.01

讨 论

mPRs的表达、分布及功能在鱼类及两栖类中研究较为深入，然而其在哺乳动物生殖系统表达、分布及功能研究刚刚起步。PAQR7、PAQR8和PAQR5又称孕激素膜受体mPRα、mPRβ和mPRγ，参与孕激素的快速调节作用。mPRα是最早被发现且研究最为深入的孕激素膜受体，该蛋白质具有和 G 蛋白偶联受体（GPCRs）相似的 7 次跨膜结构域[3]，N 端是糖基化位点和半胱氨酸残基保守区域。mPRα能与抑制性G 蛋白（Gi）直接耦联，能激活Gi 降低腺苷酸激酶的活性，使环磷酸腺苷(cAMP)合成减少，激活p42MAPK 及PI3K 途径，而产生生物学作用[1,2]。mPRα主要表达在生殖器官，包括卵巢和睾丸[2-7]。孕酮加速进入生殖细胞减数分裂的作用很可能由mPR介导[4-7]。mPRα在调节卵母细胞减数分裂成熟过程起重要作用，它能快速诱导卵细胞减数分裂，抑制颗粒细胞调亡[4]。Hagiwara等研究发现，在24h产卵周期中，整个卵巢和排卵前滤泡的mPRα 和 mPRγ的转录本始终保持相对稳定水平[5]。半光滑舌鳎鱼卵巢中克隆的cDNA，能编码新型的PAQR，其结构与mPRα (Paqr7)相似，进化过程中介于mPRα和mPRβ之间的中间产物，暂称为Paqr7b。Paqr7b对调节舌鳎鱼卵母细胞成熟有重要作用，它可能对生殖系统的其他方面（比如脑垂体功能）也有影响[6]。有研究显示鸡胚卵内表达mPRα，和mPRβ的mRNAs表达比mPRγ更高；mPRα免疫阳性细胞主要散在卵巢皮质区域，即生殖细胞分布的最大区域，mPRβ免疫反应阳性细胞广泛分布在卵巢内，免疫阳性细胞主要聚集在形态相似的生殖细胞群集，提示孕酮可能主要通过mPRs调节原始胚胎生殖细胞减数分裂启动[7]。因此，在孕酮调节生殖功能活动过程中，mPRs介导的快速非基因效应有着重要的作用。

图5 小鼠输卵管中mPRα、mPRβ和mPRγ mRNA表达水平比较。*，P＜0.01Fig. 5 mRNA expression levels of mPRα, mPRβ and mPRγ in mouse oviduct. *, P＜0.01

我们对小鼠生殖系统中mPRα、mPRβ和mPRγ的表达检测显示，在小鼠子宫内，mPRα、mPRβ免疫阳性反应分布于内膜上皮、腺体上皮、内膜基质和血管内皮，而mPRγ弱免疫阳性反应见于腺体上皮和血管内皮；在卵巢中，mPRα、β免疫阳性反应见于卵巢间质、卵母细胞、颗粒细胞和血管内皮，mPRγ而未见明显免疫阳性反应；mPRβ的mRNAs表达水平高于mPRα和mPRγ。这些结果提示，在小鼠生殖系统中，孕酮的非基因效应可能更多依赖mPRα、mPRβ的介导，尤其是mPRβ。mPRα、mPRβ和mPRγ在血管内皮均呈免疫阳性反应，提示可能参与器官血流量的调节。Kowalik等对牛输卵管内孕酮膜受体的研究显示，输卵管同侧和对侧mPRα、mPRβ和mPRγ的mRNA表达没有差异，而在发情周期的不同阶段输卵管同一处的表达不同，mPRα的mRNA在滤泡期比黄体中期表达更高，mPRα和mPRβ的mRNA在伞部比峡部表达更高[8]。对黄体中期和滤泡期的双侧输卵管各部的免疫组织化学定位检测显示，mPRα、mPRβ和mPRγ在黄体中期及滤泡期的不同侧输卵管的各部反应强度和细胞定位没有显著差别；输卵管的腔细胞呈强阳性反应，而肌细胞和间质细胞则呈阴性反应。所有的蛋白质都定位在输卵管内皮细胞，表明孕酮膜受体可能参与调节输卵管的运动、分泌功能以及器官的血流量[8]。本研究在小鼠输卵管中，三种蛋白均未见明显免疫阳性反应， 而mRNAs均有表达，mPRβ表达水平高于mPRα和mPRγ。这可能与mPRs在血管内皮表达有关，孕酮在小鼠输卵管中可能通过血管内mPRs起作用。

总之，本研究显示mPRα和mPRβ蛋白在小鼠卵巢和子宫中均有表达，且表达水平不随动情周期改变，提示它们可能构成小鼠孕酮的快速非基因效应的重要分子，为早期胚胎在子宫内发育提供稳定内环境，其具体的作用机制还有待进一步研究。