两种肉及肉制品联合检测试剂盒的质量评价

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西 西安 710048）

肉及肉制品的掺假问题是长期以来一直存在的问题，如在售价较高的牛羊肉中掺入价格低廉的猪肉，甚至鸭肉、鸡肉等，且掺假者造假手段越来越高明，一般的感官检验难以区分，因此对肉品的种属进行鉴定是当前食品安全检测研究的方向之一。目前，对于掺假肉鉴别方法主要有红外光谱分析法、色谱法、质谱法、酶联免疫法和分子生物学方法[1]，其中以物种间基因差异为基础的分子生物学方法是当前研究的热点。

本文中进行质量评价的联合检测试剂盒，是根据动物种间线粒体基因的多态性差异，分别设计特异性引物，利用实时荧光PCR联合检测方法，在一个PCR反应体系内同时对多个物种的特异性片段进行扩增，通过加入荧光染料SYBR来检测荧光信号，最后通过扩增的Ct值与对照内参的Ct值来确定阴阳性，从而建立的一种能够同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合检测方法。该方法可以同时对肉及肉制品中多种动物源性成分（猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅；驴、马、狗、兔、猫、鼠等）的单一肉制品或多种动物的混合肉制品进行检测鉴定，能够检测到的掺假比例为1%[2]。本文通过该试剂盒对本实验室保存的肉和市售肉及肉制品的检测，证实对于不同加工处理的肉制品，所设计的联合检测试剂盒均可准确检测目的种源肉。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

①仪器：ABI 7500型实时荧光PCR扩增仪，美国Life公司；旋涡混合器，海门市其林尔仪器制造公司；数显电热恒温水浴箱，上海跃进医疗器械有限公司；高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂。②试剂：组织DNA提取试剂盒，DEAOU公司；肉及肉制品联合检测试剂盒，陕西瑞奇生物科技有限公司；试剂盒SR1，可区分猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅；试剂盒SR2，可区分驴、马、狗、兔、猫、鼠。

1.2 样本来源

本试验所用的样本来自于本实验室在-18 ℃冷冻保存的已知动物种源成分的生肉，以及购买自本地各大型商超售卖的肉干制品、火腿、肉罐头等肉制品，还有个别购买于早点摊的肉包。

1.3 实验方法

1.3.1 样本DNA提取

①对食品样品进行均质处理，将不同类型的样品分开处理，防止不同动物种源食品的交叉污染。②按照组织基因组DNA提取试剂盒方法提取样品DNA。根据样本情况，取组织10～30 mg，加入230 μL裂解液和20 μL蛋白酶K，55 ℃水浴消化2～3 h，离心取上清液，加入250 μL柱平衡液，70 ℃水浴1 min，加入250 μL无水乙醇，混匀后上DNA吸附柱，将DNA从吸附柱上洗脱下来，-20 ℃保存、备用。

1.3.2 实时荧光PCR联合检测的体系及反应条件

实时荧光PCR反应体系的总体积为20 μL，其中酶反应液10 μL、双蒸水8 μL、检测引物（不同动物种源引物或者内参、阴性对照的引物）1 μL，10倍稀释后的样本模板DNA 1 μL或阴性对照1 μL。PCR反应条件为：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 45 s，共35个循环，熔解曲线为 60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。

1.3.3 结果判定

每个样本同时用SR1试剂盒和SR2试剂盒进行检测。判断方法为：用扩增的样本Ct值与内参的Ct值比对，从而确定扩增样本中是否含有特异引物对应的动物种源。当样本扩增Ct值与内参扩增的Ct值的差值的绝对值≥7时，则判定为阴性，即说明该样本中未检出特异引物对应的动物源成分，当样本扩增Ct值与内参扩增的Ct值的差值的绝对值＜7时，则判定为阳性，即说明该样本中检出特异引物对应的动物源成分。

2 结果与分析

2.1 对生肉制品的检测结果

生肉样本共计16份，对其分类，见表1。

表1 16个生肉样本的不同分类表

使用该联合检测试剂盒对表1中生肉进行实时荧光PCR检测，Ct值及判定结果见表2。检测结果表明：通过该试剂盒检出的16份生肉样本中的动物种源成分均与已知动物种源相符。说明该联合检测试剂盒可准确检测生肉样本的动物种源成分。

表2 两种联合检测试剂盒对16个生肉样本进行实时荧光PCR检测的Ct值与动物种源判定结果表

2.2 对熟肉制品的检测结果

熟肉样本共计34份，对其分类，见表3。

表3 34个熟肉样本的不同分类表

使用该联合检测试剂盒对表3中熟肉制品进行了实时荧光PCR检测，Ct值及判定结果见表4。检测结果表明：32份商超购买的样本通过该试剂盒检出的动物种源成分均与样本标签标注的动物种源相符。购自早点摊的两个样本，其中38号仅检出猪源性成分，与样本标称动物源成分相符合，而37号样本不仅检出样本标称的牛源性成分，还检出样本未标称的猪源性成分，说明该样本存在掺假问题。这34份熟肉制品的实时荧光PCR检测分析结果表明：该联合检测试剂盒可准确检测熟肉制品的动物种源成分。

表4 两种联合检测试剂盒对34个熟肉样本进行实时荧光PCR检测的Ct值及动物种源判定结果表

续表4

3 讨论

针对肉制品中动物种源，该联合检测试剂盒不但可以检测单一动物种源的肉，还可以同时检测出混合肉中相应的动物种源成分；不但能够检测未经加热处理的生肉及其制品，还能够检测经过长时间高温处理过的肉及肉制品的相应的动物种源成分，对各物种的灵敏度为1%。

该试剂盒不用设计特异性探针，通过与内参比对判定阴阳性，能够排除因沾染而造成的假阳性结果，同时由于内参和对照的存在，可以避免因为DNA的含量太少而导致的假阴性结果。

使用该试剂盒检测时，样本模板中DNA的最适浓度为50 ng/μL，该浓度下内参的Ct值约在15[2]。由于本次验证工作未进行所有样本核酸浓度的检测，仅检测其中5个样本的模板核酸浓度为100～1 000 ng/μL，在利用该试剂盒进行检测时，对所有样本模板进行10倍稀释，即最终上机检测的样本模板的核酸浓度为10～100 ng/μL，结果导致内参的Ct值在8～12，样本的Ct值在7～25这样一个较宽的区间。但是，由于最终的判定依据是内参的Ct值和样本Ct值的差值，即使在这样不完全确定核酸浓度的检测条件下，仍能够得到正确的检测结果，说明该试剂盒对模板的核酸浓度不需要太严格的要求。

综合分析，本研究验证的实时荧光PCR联合检测试剂盒能一次扩增出多种不同种类肉品对应的特异性DNA片段，可用于肉及肉制品动物源成分的真伪鉴别及掺假情况判定，特异性强，灵敏度高，操作简便，基本可以满足市场对肉及肉制品种源鉴别检测的要求。