油菜多倍体诱导技术

殷婷婷

（齐鲁工业大学(山东省科学院)食品科学与工程学院，山东济南 250353）

1 油菜多倍体诱导技术概述

油菜是十字花科植物，颜色深绿，一年生草本，直根系，茎直立，分枝较少，株高30～90 cm，叶互生，分基生叶和茎生叶两种。多倍体育种已在观赏花卉和蔬菜作物上得到广泛应用，如多倍体蔬菜常见的有无籽西瓜、黄瓜、白菜、辣椒等，多倍体花卉中常见有矮牵牛、君子兰、紫茉莉等[1]。油菜作为主要的油料作物，其经济价值和观赏价值都很高。因此，油菜的多倍体的诱导具有重要的意义。

多倍体植株一般具有植株粗壮、叶片肥大、花器官大、花色娇艳、耐储藏运输[2]；生长势强、分枝减少、生育期延长；种子增大、结实率降低；氨基酸、还原糖、维生素及矿物质含量增加；有机营养成分增多等优点[3]，因此,研究多倍体诱导在现代农业中具有重要意义。自然界中获得多倍体的过程很漫长，为此常用人工诱导的方法获得多倍体植株，分为化学方法和物理方法。物理方法包括各种射线、温度异变、调整离心力、机械创伤等，其诱变效率太低，重复性差，很难在实践中得到应用，因而在多倍体的诱导研究中往往采用化学方法，诱导多倍体的化学药品有很多，主要有秋水仙素、氯乙醛、笑气、富民等，其中秋水仙素被广泛采用[2]。秋水仙素是微管特异性药物，主要作用是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，阻止染色体移向两级移动，停留在分裂中期，细胞不能继续分裂，从而产生染色体加倍的细胞，细胞继续分裂，产生多倍体植株[4]。

秋水仙素对不同植物的作用存在差异，有研究表明，一般秋水仙素的有效浓度在0.01%～0.4%，而以0.2%左右的浓度为最常用。在实际应用中，0.2%的浓度常设为标准浓度，向上或向下筛选合适的浓度。利用秋水仙素处理材料的时间一般大于24 h，据报道处理时间一般为2～6 d，但浓度很低时处理时间有的会长达30 d。总之，处理浓度高时，处理时间可能会相应缩短；反之，处理时间会相应延长。处理温度一般为18～25℃，此温度下细胞分裂与植物生长旺盛，处理效果较好[5]。

秋水仙素处理材料的方法有：浸渍法、滴液法、涂抹法、注射法。其中浸渍法简单易行，便于操作，诱导效率高[6]。运用秋水仙素溶液直接浸泡种子的方法已成功的在菊花脑、小白菜、君子兰[7-9]等植物上诱导出了多倍体。借鉴前人研究的基础上，本试验即采用了浸种法并期望获得多倍体植株，以期为下一步多倍体植物育种奠定一定的研究基础。

2 材料与方法

2.1 材料及试剂 试验用材料为市售的油菜种子，秋水仙素、无水乙醇、冰醋酸、卡诺氏固定液、5 mol/L盐酸、45%醋酸、1%龙胆紫以及Hoagland营养液。

2.2 油菜种子处理 本试验采用浸种法，选取籽粒饱满的油菜种子。先用蒸馏水浸泡12 h，催根、芽萌动后倒掉水分，种子用0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的秋水仙素溶液分别进行12 h、24 h、48 h浸泡处理(浸没种子的2/3)，由于秋水仙素溶液见光易分解，因此在处理时放置黑暗处。另有一组为对照组，浸在蒸馏水中处理相同时间。药物处理结束后，取出种子，用蒸馏水冲洗种子及根2～3次去除残留的秋水仙素。将萌发种子移到装有Hoagland营养液的培养皿中25 ℃光照培养，每天光照14 h，培养发芽。根尖长到1～2 cm，选取健壮根尖将根尖固定后保存于70%乙醇中，用于观察染色体加倍情况。

2.3 形态变异率统计 5 d后，以根茎部位明显变短、膨大作为形态变异指标，统计变异株占总苗数的百分率。

2.4 形态学观察 7 d后，测定各实验组植株的株高，每组随机选取10株健壮的植株进行株高测量。其中，株高为自植株基部到顶端的自然高度。取对照和多倍体植株叶片的同一部位观察气孔保卫细胞的变化。

2.5 细胞学观察 取出早期保存于70%乙醇中的根尖，投入卡诺氏固定液（现用现配）中固定(30 min)，将固定好的根尖用蒸馏水冲洗2次放入5 mol/L盐酸中处理5～10 min，当根尖的伸长区变透明而分生区呈乳白色时即可取出。将解离好的材料用蒸馏水冲洗后，转入45%醋酸中软化10 min。将软化好的根尖放在载玻片上，用刀片切去伸长区，只留下1～2 mm的分生区。滴1滴龙胆紫染色液染色3～5 min。染色完毕后用吸水纸吸去多余的染液并用蒸馏水冲洗，然后将材料移至另一清洁的载玻片上，覆以盖玻片，以铅笔的橡皮头端轻轻敲打盖玻片，使材料呈现分散的薄层，置光学显微镜（1 000倍）下观察。

3 结果与分析

3.1 秋水仙素对油菜的诱变效应 以植株根茎部粗大作为形态变异指标，由表1可知，秋水仙素浓度相同时，随着处理时间的延长，死亡率随之增高，说明处理时间越长，秋水仙素对种子的毒害就越大。处理时间相同时，随着处理浓度的变大，死亡率随之增高，表明处理浓度越大，秋水仙素对种子的毒害也越大。由诱变率可知，虽然0.4%的浓度处理油菜48 h变异率为86.7%，但由于死亡率为63.3%远大于0.2%的浓度处理24 h的13.3%，效果欠佳。因此，油菜以0.2%秋水仙素处理24 h诱导效果最佳，诱变率为63.3%。

表1 不同浓度秋水仙素和处理时间对油菜的诱导效果

3.2 秋水仙素对油菜株高的影响 对照播种后第2 d开始出苗，而且出苗一致，到第3 d大致出齐，而经秋水仙素处理过的种子出苗则相应延迟，生长速度明显迟缓，根部粗短，茎增粗，子叶加厚，叶片浓绿且发亮，叶片皱缩。说明经秋水仙素对萌动中的种子有一定的毒害作用（如图1所示）。

由图1可以看出，同一浓度的秋水仙素随着处理时间的延长对油菜株高的抑制作用越来越明显。同一处理时间相同的情况下，株高随着秋水仙素浓度的递增呈现一个下降的趋势，说明无论是低浓度还是高浓度的秋水仙素对株高均呈现抑制作用。

3.3 油菜多倍体鉴定 在光学显微镜（1 000倍）下观察对照及变异油菜叶片的气孔保卫细胞，结果显示加倍后的气孔保卫细胞明显变大（图2，a、b）。采用根尖压片对变异植株和二倍体植株分别进行染色体鉴定。光学显微镜（1 000倍）下观察，可见与对照植株相比，变异植株染色体数明显加倍（图2，c、d）。

图1 不同秋水仙素浓度和处理时间对油菜株高的影响

图2 二倍体与多倍体的染色体和气孔比较（a、c：二倍体；b、d：多倍体）

4 讨论与结论

多倍体育种中秋水仙素仍然是应用最广泛的化学试剂之一，研究表明，多倍体诱导成功的关键因素是把握好秋水仙素的浓度以及处理时间。浓度过低以及处理时间过短都难以取得理想的诱变效果，而高浓度的秋水仙素或处理的时间过长都会对种子产生毒害作用[10]。通过秋水仙素诱导获得的油菜变异株：植株粗壮，叶片增厚，叶片深绿，保卫细胞增大，植物生长速度缓慢，这些表现基本同一般多倍体变异一致[11]。因此，在多倍体诱导过程中，可以将形态及气孔特征的变异作为筛选多倍体的初步鉴定指标，在此基础上通过染色体的鉴定进一步确定变异植株，这样可以简化操作过程，缩短工作时间。本试验采用了秋水仙素溶液浸泡种子法，研究了不同浓度相同处理时间对植物倍性的影响，并通过形态观察、气孔观察、染色体鉴定方法对多倍体的初步特征进行了研究。试验得出诱导油菜的最佳组合是0.2%秋水仙素处理24 h。此研究结果对下一步多倍体油菜育种奠定了一定的研究基础。