矿物质复合微量元素对乳酸菌生长及生物学特征的影响

孔 洁， 张 涵， 李亭玉， 李艳茹， 张 敏， 李太元

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

矿物质是地壳中自然存在的天然元素。土壤矿物质是由地壳的矿物岩石经过风化而形成的土壤中大小不同的矿物质颗粒[1]。来自地质体的地球化学元素通过岩石→土壤→生物垂直系统的运营、转化、富集，是影响生物的生理生化过程、营养价值及有机组分含量特别是矿物质含量的重要因素，导致不同地区、不同种类的植物中矿物质含量的差异[2]。土壤矿物质(如高岭土、针铁矿等)是土壤的重要组成成分，它们对土壤自身有机质的吸附保护作用可以提高其自身有机质的稳定性[3]。微量元素含量的相关性可能取决于生态环境、元素在植物体内的分布以及运转状况等原因，导致微量元素本身之间协同或拮抗作用的原因复杂，有待于进一步研究[4]。

乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是一类能发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性、不产芽孢的微生物，是益生菌中最具代表性的菌属[5]。乳酸菌作为一种优良益生菌，在动物肠道内发挥有效的生理功能，调节肠道内正常菌群的平衡，参与多种维生素的合成。乳酸菌发酵过程中的抑菌代谢产物包括有机酸和细菌素，乳酸菌细菌素作为一类生物抑菌剂近年来得到了广泛关注[6]。本试验采用矿物粉作为试验材料，研究矿物粉对保加利亚乳杆菌、李糖鼠乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌等4种受试菌种的生长及生物学特性，对进一步开发利用矿物粉资源和乳酸菌生长提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1) 菌种 保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricuscode：1.1480)；李糖鼠乳杆菌(Lactobacillusrhamnosuscode：1.1046)；乳酸乳球菌(Lactococcuslactiscode：1.2470)嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophiluscode：1.1854)。试验菌种均购自中国科学院微生物研究所。

2) 药品与试剂 矿物质复合微量元素制剂(由天然矿物调制而制成的复合微量元素制剂)；K粉(由微生物实验室提供)；MRS肉汤(营养肉汤)；琼脂粉；均购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备

试验菌种以划线法接种于MRS琼脂平板上，37 ℃培养18～24 h[7]。用接种环挑取平板中3～5个菌落，接种在MRS液体试管中，于37 ℃厌氧培养18～24 h，使其OD值分布在0.7±0.1之间，于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 K粉对乳酸菌增殖的影响

在MRS液体培养基中添加K粉，制备含K粉浓度梯度液体培养基。设置K粉浓度梯度分别为0，0.1%，0.2%～0.9%，1%，2%～10%，于121 ℃，15 min高压灭菌备用。取乳酸菌菌悬液100 μL，分别接种到MRS液体梯度试管中混匀，置37 ℃条件下厌氧培养48 h。

培养菌液采用平板计数法计细菌数，重复3次，取平均值，分析K粉对乳酸菌增殖的最适作用浓度。

1.2.3 K粉对乳酸菌酸碱耐受性的影响

制备含有最适浓度K粉(1.2.2)的MRS液体培养基试管(标记为K-乳酸菌，下同)和空白MRS液体培养基试管(标记为P-乳酸菌，下同)，分别用1 mol/L HCL和1 mol/L NaOH调节pH梯度，使用pH酸度仪调整pH梯度分别为2、4、6、7、9、10，取乳酸菌菌悬液100 μL，分别接种到MRS液体试管中混匀，置37 ℃条件下厌氧培养48 h。培养菌液采用平板计数法计细菌数，重复3次，取平均值，分析K粉对乳酸菌酸碱耐受性的影响。

1.2.4 K粉对乳酸菌温度耐受性的影响

制备含有最适浓度K粉的MRS液体培养基试管和空白MRS液体培养基试管，取乳酸菌菌悬液100 μL，分别接种到MRS液体试管中混匀，将试验组试管分别置于40、60和80 ℃中水浴加热10，20，30 min处理，37 ℃条件下厌氧培养48 h。培养菌液采用平板计数法计细菌数，重复3次，取平均值，分析K粉对乳酸菌温度耐受性的影响。

1.2.5 K粉对乳酸菌生长曲线的影响

制备含有最适浓度K粉的MRS液体培养基试管和空白MRS液体培养基试管，取乳酸菌菌悬液100 μL，分别接种到MRS液体试管中混匀，置37 ℃条件下厌氧培养48 h，每3 h取1次菌液，共计16次。培养菌液采用平板计数法计细菌数，重复3次，取平均值，分析K粉对乳酸菌生长曲线的影响。

1.2.6 K粉对乳酸菌抑菌效果的影响

制备含有最适浓度K粉的MRS液体培养基试管和空白MRS液体培养基试管，取乳酸菌菌悬液100 μL，分别接种到MRS液体试管中混匀，37 ℃条件下厌氧培养。将上述培养的乳酸菌菌液取出，以10 000 r/min离心2 min，取上清液用2.2 μm滤菌膜过滤，即为乳酸菌代谢产物[8]。将药敏片浸泡于乳酸菌代谢产物中，浸泡30 min即可。制作0.5号麦氏浊度[9]的大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌的菌悬液(或经比浊法和活菌计数法测定，配制成1×106cfu/mL菌液[10])，采用K-B法[11]，37 ℃条件下培养24、48 h后，测试4种乳酸菌代谢产物对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌的抑菌效果，重复3次，分别测抑菌圈直径，取平均值，分析K粉对乳酸菌代谢产物抑菌效果的影响。

2 结果与分析

2.1 K粉浓度对乳酸菌增殖的影响

由图1可知，与空白组(即0 g/mL)相比，K粉对乳酸菌的生长均有促进作用，随着K粉浓度的增加，乳酸菌的数量不断增加，当K粉浓度分别达到0.1、0.25、0.25和0.5 g/mL时，保加利亚乳杆菌、李糖鼠乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌的细菌数达到峰值，随着K粉浓度不断提高，乳酸菌的数量逐渐缓慢下降。

图1 K粉浓度对乳酸菌的影响Fig.1 Effect of K powder concentration on lactic acid bacteria

2.2 K粉对乳酸菌耐酸碱作用的影响

由图2可知，与空白组相比，K粉增强了保加利亚乳杆菌、李糖鼠乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌的酸碱耐受能力，当pH值为4时，K粉对李糖鼠乳杆菌、嗜酸乳杆菌的酸碱作用最强；当pH值为9时，K粉对保加利亚乳杆菌的耐碱能力最大。

图2 K粉对乳酸菌酸碱耐受能力的影响Fig.2 Effect of K powder on acid and alkali tolerance of lactic acid bacteria

2.3 K粉对乳酸菌温度耐受性的影响

由图3～6可知，乳酸菌经40 ℃热处理后，对其菌体生产基本不产生影响；乳酸菌经60 ℃ 10 min热处理后，K粉对保加利亚乳杆菌的温度耐受能力大于空白对照组；但经60和80 ℃热处理后，添加K粉后嗜酸乳杆菌的细菌数与空白对照组细菌数无明显变化。与空白组相比，K粉对保加利亚乳杆菌、李糖鼠乳杆菌、乳酸乳球菌的温度耐受能力有一定的提高，但高温处理后，对嗜酸乳杆菌的温度耐受能力无明显作用。

图3 K粉对保加利亚乳杆菌温度耐受能力的影响Fig.3 Effect of K powder on temperaturetolerance of Lactobacillus bulgaricus

图4 K粉对李糖鼠乳杆菌温度耐受能力的影响Fig.4 Effect of K powder on temperaturetolerance of Lactobacillus rhamnosus

图5 K粉对乳酸乳球菌温度耐受能力的影响Fig.5 Effect of K powder on temperature tolerance of Lactococcus lactis

图6 K粉对嗜酸乳杆菌温度耐受能力的影响Fig.6 Effect of K powder on temperaturetolerance of Lactobacillus acidophilus

2.4 K粉对乳酸菌生长曲线的影响

由图7可知，与空白组相比，K粉缩短了保加利亚乳杆菌的适应期(由0～12 h至0～9 h)，提高了对数生长期的生长速度；延长了李糖鼠乳杆菌的对数生长期(由6～36 h至6～39 h)，提高了对数生长期的生长速度；缩短了乳酸乳球菌的适应期(由0～9 h至0～6 h)，提高了对数生长期的生长速度；缩短了嗜酸乳杆菌的适应期(由0～12 h至0～9 h)，提高了对数生长期的生长速度。

图7 K粉对乳酸菌生长曲线的影响Fig.7 Effect of K powder on lactic acid bacteria growth curve

2.5 K粉对乳酸菌细菌素抑菌作用的影响

由图8～11可知，乳酸菌培养24 h后，在最适K粉作用浓度下，乳酸菌代谢产物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用均大于空白对照组；乳酸菌培养48 h后，乳酸乳球菌代谢产物对大肠杆菌、沙门氏菌无抑菌作用，李糖鼠乳杆菌代谢产物对金黄色葡萄球菌无抑菌作用，在最适K粉作用浓度下，保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌代谢产物对3种细菌的抑菌作用均大于空白对照组。因此，乳酸菌培养24 h比培养48 h后所产生的代谢产物更多，且K粉提高了乳酸菌代谢产物对3种细菌的抑制作用。

图8 K粉对保加利亚乳杆菌代谢产物抑菌作用的影响Fig.8 Effect of K powder on bacteriostaticability of Lactobacillus bulgaricus

图9 K粉对李糖鼠乳杆菌代谢产物抑菌作用的影响Fig.9 Effect of K powder on bacteriostaticability of Lactobacillus rhamnosus

图10 K粉对乳酸乳球菌代谢产物抑菌作用的影响Fig.10 Effect of K powder on bacteriostaticability of Lactococcus lactis

图11 K粉对嗜酸乳杆菌代谢产物抑菌作用的影响Fig.11 Effect of K powder on bacteriostatic ability of Lactobacillus acidophilus

3 讨论

在岩石→土壤→生物的生态系统中，土壤是维持矿物质循环的基础[12]，是维系生态系统里生命体的主要来源，矿物元素的缺乏和不足会影响到动植物元素水平的高低，矿物元素在土壤、微生物体内存在一定的相关性。矿物粉为乳酸菌的生长除了提供基础的常量元素外，还为乳酸菌的增殖生长提供了微量元素。本试验设置不同矿物粉浓度的结果表明，当K粉浓度分别达到0.1、0.25、0.25和0.5 g/mL时，保加利亚乳杆菌、李糖鼠乳杆菌、乳酸乳球菌和嗜酸乳杆菌的细菌总数达到峰值，矿物粉不仅促进乳酸菌生长繁殖，缩短乳酸菌的生长适应期，同时能够延长其对数生长期，提高菌体对数期的增长速度。

正常胃液pH值为1.5～2.0，胃液中的盐酸可以杀死随食物进入胃内的细菌[13]，胃酸的分泌导致胃内pH值呈酸性，过低的pH值影响乳酸菌的生长。此外，熊素玉等[14]发现，培养液pH值的动态变化主要是由乳酸菌在生长过程中产生乳酸引起，乳酸的积累影响乳酸菌的生长，乳酸是一种解偶联剂，起到使质子从培养液中进入细胞的质子泵作用，随着乳酸的积累，胞外与胞内的pH值均下降，进而抑制乳酸菌的生长。本试验调节不同pH值梯度的结果表明，矿物粉可以提高乳酸菌的酸碱耐受能力，为乳酸菌培养过程中的耐酸碱度提供了一定的理论依据。

温度是微生物生命活动中重要的环境因子，当温度改变时，微生物必须通过调节脂类的组成、胞内酶的活性、蛋白质的合成、基因调控和RNA的合成以适应环境温度的变化[15]。同时，环境温度会影响活菌制剂的生产、运输、保存及使用[16]。本试验对乳酸菌分别设置3个温度[17]的结果表明，矿物粉可以提高保加利亚乳杆菌、李糖鼠乳杆菌、乳酸乳球菌对温度的耐受能力，但高温处理后，对嗜酸乳杆菌的温度耐受性无明显变化。乳酸菌实际生产过程中，适宜的温度可以缩短乳酸菌的凝乳时间，过高或过低的环境温度都可导致菌体蛋白变形，菌体代谢发生改变，从而导致乳酸菌失活。

乳酸菌自身在代谢过程中能够产生多种抑菌物质，这些物质在细菌体内的核糖体中合成具有抑菌活性的多肽类物质，能够对多种细菌产生抑菌作用[18]。乳酸菌细菌素是细菌通过核糖体合成机制产生并分泌到环境中的一类对同种或亲缘关系较近的一种有抑菌活性的低分子质量的蛋白或多肽类物质[19]。本试验培养不同时间内乳酸菌代谢产物的结果表明，矿物粉可以提高乳杆菌的代谢产物，其生理作用抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的生长。乳酸菌在食品加工生产中产生的代谢产物(如乳酸及乳酸菌素)，不仅可以增加乳酸食品的味觉，同时还能够抑制某些微生物的繁殖生长[20]。

4 结论

本试验采用矿物粉作为材料进行试验的结果表明，矿物粉可以促进保加利亚乳杆菌、李糖鼠乳杆菌、乳酸乳球菌和嗜酸乳杆菌的生长，其最适作用浓度分别为0.1、0.25、0.25、0.5 mg/mL。此外，矿物粉在一定程度上提高了乳酸菌对酸碱、温度的耐受能力，其代谢产物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均起到相对抑制的作用。矿物粉作为一种天然的复合材料，为乳酸菌培养过程中微量元素的添加提供了一定的理论基础。