东方泰勒虫PCR-ELISA检测方法的建立

孙 静， 于龙政， 薛书江， 李海峰， 许应天

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

东方泰勒虫病是由泰勒科、泰勒属的东方泰勒虫(Theileriaorientalisi) 旧称瑟氏泰勒虫(Theileriasergenti)寄生于牛红细胞和淋巴细胞内所引起的一种蜱传性原虫病，临床上以高热、贫血、出血、消瘦和体表淋巴结肿大为主要特征。本病有明显的季节性，新引进牛和改良牛的发病率、病死率均高。近年来，东方泰勒虫病在我国东北、西北、华北、华南等地区流行严重，给养牛业带来了巨大的经济损失[1]。目前，东方泰勒虫病的实验室诊断有乳胶凝集试验 (LA)、间接荧光抗体试验 (IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)等[1-6]，而至今尚未见有关东方泰勒虫PCR-ELISA的报道。本研究旨在根据东方泰勒虫主要表面蛋白(MPSP)基因的可变区设计合成引物，建立适合于东方泰勒虫病的流行病学调查和口岸检疫的PCR-ELISA检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1) 材料 东方泰勒虫基因标准品为瑟氏泰勒虫p33基因重组质粒，由延边大学预防兽医学实验室自制保存。阴性对照样本为经常规PCR检测为东方泰勒虫感染阴性的健康牛血液基因组DNA。被检样本112份为牛抗凝血中提取的基因组DNA，血液样本为采自吉林省珲春市某养牛场。

2) 主要试剂 血液DNA提取试剂盒和质粒提取试剂盒(OMEGA生物公司)；Ex Taq DNA聚合酶、DNA Marker(大连宝生物工程有限公司)；链霉亲和素(上海生工生物工程技术服务有限公司)；TMB显色液、鲑鱼精DNA(Sigma公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗地高辛抗体(鼎国公司产品)。

3) 合成引物 根据GenBank中公布的东方泰勒虫p33蛋白基因序列(DQ078264)，用Primer Permie 5.0和Oligo 6软件设计1对引物，并其上下游引物的5’端分别标记上生物素(BIOT)和地高辛(DIG)，该引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

P1上游：5’- BIOT-AGG GAT ACC GCA TCA AGA CAC-3’

P2下游：5’-DIG- TCA TCG GAA CCG ACG TAA ACT-3’。

1.2 PCR-ELISA检测方法的建立

1) PCR扩增及最佳退火温度的筛选 PCR扩增以东方泰勒虫标准品为模板，在50 μL体系中进行：10× Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，模板DNA 4 μL，引物1、2各2 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL，去离子水补齐至50 μL。扩增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，50～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共25个循环；72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR产物于15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳检测，以条带亮度判断最佳退火温度。

2) ELISA检测 将链酶亲和素用0.05 mol/L，pH值9.5的碳酸盐缓冲液稀释，100 μL/孔包被酶标板，4 ℃过夜，用PBST洗板5次；用含40 mg/L脱脂乳的PBS稀释鲑鱼精DNA，200 μL/孔封闭酶标板，37 ℃孵育2 h，同上法洗板3次；用PBS稀释PCR产物，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板5次；用PBS稀释HRP标记的抗地高辛抗体，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板5次；每孔加入100 μL临时配置的TMB-H2O2显色液，室温避光显色； 最后加入50 μL 2M H2SO4终止反应，于酶标仪上测定OD450nm值。

3) ELISA最佳反应条件的优化 在相同反应条件下，对链酶亲和素包被浓度(10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL)和HRP标记的抗地高辛抗体稀释度(1∶1 000～1∶5 000)做方阵滴定。对封闭液鱼精DNA浓度(0.25、0.50、1.00、2.00 mg/mL)和封闭时间(5、90、120 min)进行筛选优化。分别在显色液10、25、20和25 min后终止反应，测定OD450nm值。

5) 敏感性试验 以超微量分光光度计测定收集的东方泰勒虫套式PCR阳性产物DNA含量，用去离子水稀释成10倍浓度梯度，以得到的不同浓度DNA为模板，按所建立的PCR-ELISA进行检测，同时进行常规PCR做比较，评价其敏感性。

6) 特异性试验 对弓形虫、环形泰勒虫、新孢子虫及健康牛血的基因组DNA，按所建立的PCR-ELISA进行检测，评价其特异性。

7) 重复性评价 在同一批次包被的酶标板上对4份东方泰勒虫套式PCR阳性产物进行重复性试验，每份重复5次，评价其批内重复性。在5个不同批次包被的酶标板上对4份东方泰勒虫套式PCR阳性产物进行批间重复性试验，测定OD450nm值，计算变异系数。

8) 被检样本的检测 用所建立的PCR-ELISA对采自珲春市某牧场的112份被检血液样本基因组DNA进行检测，同时进行常规PCR检测，比较两者的阳性检出率。

2 结果与分析

2.1 PCR最佳退火温度的筛选

以上述PCR反应体系，分别在50，51，52，54，56，58，59，60 ℃的退火温度下进行PCR扩增，结果在56 ℃时目的条带最亮，因此,确定56 ℃为最佳退火温度(图1)。

M：DL 2 000 DNA Marker；1：50 ℃；2：51 ℃；3：52 ℃；4：54 ℃；5：56 ℃；6：58 ℃；7：59 ℃；8：60 ℃

图1温度梯度PCR结果

Fig.1PCRresultsattemperaturegradient

2.2 ELISA最佳反应条件的确定

经试验确定链酶亲和素包被浓度为5 μg/mL，HRP标记的抗地高辛抗体稀释度为1∶2 000(表1)，鱼精DNA浓度1 mg/mL，封闭1 h(表2)，显色15 min为最佳反应条件(表3)。

表1 链酶亲和素及HRP标记抗地高辛抗体方阵检测的P/N值

表2 封闭液各工作浓度及时间检测的P/N值

表3 显色时间的确定

2.3 PCR-ELISA判定标准的确定

2.4 敏感性试验

以PCR-ELISA对浓度分别为18、1.8、0.18 ng/μL和18、1.8、0.18 pg/μL的东方泰勒虫基因组DNA检测。结果显示，常规PCR能检测的最低模板浓度为0.18 ng/μL(图2)，而所建立的PCR-ELISA能检测的最低模板浓度为18 pg/μL，证明PCR-ELISA的敏感性比常规PCR高10。

M：DNA分子质量标准；1～6：DNA 浓度分别为18、1.8、0.18 ng/μL和18、1.8、0.18 pg/μL.

图2PCR-ELISA及常规PCR敏感性的检测结果

Fig.2ThesensitivitydetectionofthepurifiednucleicacidsextractedfromT.orientalisibyPCR-ELISAandPCR

2.5 特异性试验

用所建立的PCR-ELISA对牛弓形虫、牛环形泰勒虫、牛新孢子虫及健康的牛血液基因DNA进行检测，结果除东方泰勒虫外，其他OD450nm值均小于判定标准，无交叉反应，OD450nm值分别为0.132、0.103、0.119和0.104。结果表明，所建立的PCR-ELISA方法特异性好，无交叉反应。

2.6 重复性试验

按照所建立的方法，求得批内变异系数为6.23%～7.84%，批间变异系数为5.11%～7.19%，均低于10%，证明本方法具有较好的重复性。

2.7 临床样本检测

用所建立的PCR-ELISA法及常规PCR法，对112份待检样本进行检测的结果表明，常规PCR阳性检出率为28.6%(32/112)，PCR-ELISA阳性检出率为34.8%(39/112)，其中常规PCR检测为阴性的7份样本经PCR-ELISA检测均为阳性，阳性符合率为82.1%(表4)。

表4 PCR-ELISA法与常规PCR法的比较

3 讨论与结论

东方泰勒虫的常规检测以血涂片镜检和常规PCR为主，但众所周知，血涂片镜检敏感性较低，常规PCR虽因其简便快速，被广泛应用于各病原体的检测，但该方法需要使用溴化乙锭染色，存在一定的安全隐患，结果以对条带的直观观察为准，影响敏感度，两者均不适合于批量样本的检测。因此，本研究建立了适合于批量样本检测的东方泰勒虫PCR-ELISA。

东方泰勒虫P33蛋白是红细胞感染阶段表达在虫体表面的一种膜内蛋白，该蛋白基因的开放阅读框长度为849 bp，编码以亮氨酸leu、赖氨酸lys为主的283个氨基酸，亲水性较好，该蛋白抗原决定簇丰富，被认为是诊断和预防东方泰勒虫病的最佳候选抗原[7-8]。因此，本研究以东方泰勒虫p33基因作为靶基因建立了T. sergenti的PCR-ELISA。

传统的PCR-ELISA 是一种集杂交探针特异性、PCR定性分析、ELISA定量检测及酶标仪结果客观性等优点的检测技术[9-10]，有效地避免了常规PCR的假阳性和假阴性结果[11]，并且操作中不需要特殊仪器试剂，避免接触放射性物质，已被广泛运用于各个领域[12-13]。本试验在传统的PCR-ELISA基础上进行了改良和优化，即在PCR的上、下游引物上分别标记生物素和地高辛，使PCR产物两端直接带标记物，省去探针杂交过程，简化了操作。由于本研究采用了链霉亲和素—生物素和地高辛—抗地高辛抗体系统，其敏感性高于单纯的 PCR和ELISA检测，能检出18 pg/μL的T.orientalisi基因组DNA，是常规PCR的10倍，且不与环形泰勒虫、弓形虫和新孢子虫发生交叉反应，批内、批间变异系数均低于10%，说明所建立的东方泰勒虫PCR-ELISA具有较好的敏感性和特异性，而且重复性良好，该结果与夏晓辉等[5]报道的基本一致。

由于PCR-ELISA的操作在开发环境中进行，且根据各孔的OD450nm值判断结果，所以规范化操作是试验准确性的保证。所以PCR过程和ELISA操作需在2个独立环境下进行，避免相互污染，造成假阳性。如果PCR产物的稀释在孔中进行，由于分子量较大的PCR产物扩散缓慢，就会影响其与孔底链霉亲和素的结合，所以PCR产物的稀释应在外界进行。

用所建立的PCR-ELISA对112份待检样本进行T.orientalisi检测的结果表明，阳性检出率为34.8%，高于常规PCR的结果(28.6%)，其中，常规PCR检测为阴性的7份样本经PCR-ELISA检测为阳性，有效地防止了对隐性感染病例的漏诊。综上所述，本研究建立的东方泰勒虫PCR-ELISA具有敏感、特异、快速、安全等优点，适用于东方泰勒虫病的分子流行病学调查和口岸检疫等批量T.orientalisi的检测。