不同日龄五指山猪胰腺胰岛的组织学及免疫组织化学研究

李雪成， 牛云超， 吕育芝， 刘 伟， 崔成都*

(1.吉林省转基因动物与胚胎工程重点实验室，吉林 延吉 133002；2.长春西诺生物科技有限公司 吉林 长春 130012)

胰岛移植可有效治疗人类Ⅰ型糖尿病[1-2]，但由于人类胰岛供体不足，因此需要寻找与人类胰岛相似的供体。研究表明，猪胰岛素和人胰岛素仅差1个氨基酸序列[3-4]，且猪胰岛容易获得，功能较好，故认为猪胰岛是最适宜的供体来源[5]。Svenstrup等[6]认为，哪个年龄段的猪胰岛更适应于人类进行异种移植尚不明确。因此，试验以出生后不同日龄的五指山猪胰腺为材料，采用组织学及免疫组织化学技术，研究胚后发育规律，为胰岛异种植[7]提供基础形态学资料。

1 材料与方法

1.1 材料

取出生1～10、40、120及180 d健康五指山猪胰腺各5例(均取自龙井市某猪场)。并将其放入中性福尔马林中固定24 h以上。

1.2 方法

1.2.1 胰腺组织标本制作及HE染色

固定后的胰腺组织经过水洗、脱水、石蜡包埋、制作5 μm厚组织切片、HE染色后，镜下观察。

1.2.2 胰岛A、B、D细胞的免疫组化检测

首先将切片脱蜡，然后通过微波炉修复抗原，使用兔抗人胰岛素多克隆抗体，兔抗人胰高血糖素多克隆抗体和兔抗人生长抑素多克隆抗体SABC即用型免疫组化试剂盒(中杉金桥)进行染色[8]，然后苏木素染色2 min，酒精脱水，二甲苯透明封片，镜下观察。对照组是将上述过程中试剂盒中的一抗用PBS替换，其他步骤同上。

1.2.3 使用IMAGE J2X软件测量分析

分析出胰岛A、B、D细胞阳性信号的分布面积,并进行分析汇总。

2 结果与分析

2.1不同日龄五指山猪胰腺的组织学特点

五指山猪的胰腺表面含有发达的结缔组织，能够将胰腺分隔为若干小叶，实质可分内分泌和外分泌2部分。外分泌部占据胰腺的大部分，腺泡有泡状和管状等形态，大小也不一。1～10、180 d五指山猪胰腺表面被一层疏松结缔组织包裹，小叶间结缔组织不发达(图1,A、D)。然而，五指山猪胰腺第40、120天与其相反，小叶间结缔组织内含有较

多脂肪组织(图1,B、C)。1～10 d五指山猪的胰腺内外分泌部的分化不完全，没能见到典型胰岛(图3 A)；40 d、120 d和180 d五指山猪的胰岛的轮廓清晰，分散在存于外分泌部，胰岛细胞不着色或着色较浅(图1，B、C、D)。

A.1～10 d五指山猪胰腺；B.40 d五指山猪胰腺；C.120 d五指山猪胰腺;D.180 d五指山猪胰腺。实心箭头示胰岛，空心箭头示脂肪。

图1不同日龄五指山猪胰腺组织HE(×200)

Fig.1PancreatictissueofWuzhishanpigsatdifferentagesHE(×200)

2.2 不同日龄五指山猪胰腺胰岛的免疫组织化学染色结果

免疫组织化学染色后的切片背景呈淡蓝色，胰岛素、高血糖素和生长抑素的免疫反应阳性细胞的细胞质中具有黄色或棕黄色颗粒，但是对照组切片没有黄色或棕黄色颗粒(图2，E)，呈阴性，表明本试验中使用的免疫组织化学染色对细胞的免疫反应具有特异性。

2.2.1 胰岛素免疫反应阳性细胞的分布特点

1～10 d的五指山猪的胰腺胰岛素免疫阳性细胞，在外分泌腺的上皮细胞分散存在(图2，A)；40、120及180 d五指山猪的胰腺的胰岛素免疫反应阳性细胞，绝大部分成团的散在于胰岛内，外分泌部的腺泡上皮细胞间偶见少量阳性细胞(图2，B、C、D)。

A.1～10 d五指山猪胰腺；B.40 d五指山猪胰腺；C.120 d五指山猪胰腺；D.180 d五指山猪胰腺。箭头示胰岛素免疫反应阳性细胞；E.对照组五指山猪胰腺(各年龄段均无黄色或棕黄色颗粒，因此取一图，此图同样适用于下图)

图2不同日龄五指山猪胰腺胰岛素免疫反应阳性细胞(Ins-IR)分布(×200)

Fig.2Distributionofinsulinimmunoreactivecells(Ins-IR)inpancreasofWuzhishanpigsatdifferentages(×200)

2.2.2 胰高血糖素免疫反应阳性细胞的分布特点

1～10 d五指山猪的胰腺胰高血糖素的阳性细胞面积小，有些甚至单个散在于外分泌腺的上皮细胞、叶间导管以及小叶内导管的上皮细胞间(图3，A)；40和120 d五指山猪胰腺胰的高血糖素阳性细胞，主要分布于胰岛的周围，并且面积较1～10 d的大(图3，B、C)；180 d五指山猪胰高血糖素的阳性细胞，数量较少，散在于胰岛的外周,而其他构成胰岛的细胞胞浆内偶见较小的阳性颗粒(图3，D)。

A.1～10 d五指山猪胰腺；B.40 d五指山猪胰腺；C.120 d五指山猪胰腺；D.180 d五指山猪胰腺。箭头所示为胰高血糖素免疫反应细胞

图3不同日龄五指山胰腺胰高血糖素免疫反应阳性细胞(Glu-IR)分布(×400)

Fig.3Distributionofglucagonimmunoreactivecells(Glu-IR)inpancreasofWuzhishanpigsatdifferentages(×400)

2.2.3 生长抑素免疫反应细胞胚后发育过程中的分布特点

1～10 d五指山猪的生长抑素阳性细胞数量较胰高血糖素阳性细胞更少，但分布却与其相似(图4，A)；40 d五指山猪生长抑素的阳性细胞面积较小，数量较少，散在于胰岛细胞内(图4，B)；在第120、180天五指山猪的生长抑素阳性细胞数非常低，仅能在其他构成胰岛细胞的胞浆内发现少量阳性颗粒(图4，C、D)。

A：1～10 d五指山猪胰腺；B:40 d五指山猪胰腺；C.120 d五指山猪胰腺；D:180 d五指山猪胰腺.箭头示胰腺生长抑素免疫反应细胞。

图4不同日龄五指山胰腺生长抑素免疫反应
阳性细胞(Som-IR)分布(×400)

Fig.4Distributionofsomatostatinimmunoreactivecells
(Som-IR)inpancreasofWuzhishanpigsatdifferentages(×400)

2.3 用Image软件对数据进行处理分析

通过Image软件测量各个年龄段猪胰岛细胞阳性信号面积并分析。在每组中随机抽取5张切片，每张切片选定5个明显的阳性信号轮廓，然后用Image软件侧量其阳性信号的面积，得出如下数据(表1)。结果显示，五指山猪胰岛A、B、D细胞的分布面积均随猪年龄的增加而增大。1～10 d与40 d、120 d、180 d猪胰岛A、B、D细胞的阳性分布面积有极显著性差异(P<0.01)，40 d与120 d的阳性分布面积有显著性差异(P<0.05),120 d与180 d阳性分布面积有显著性差异(P<0.05)。

表1 胰岛A、B、D细胞免疫组化阳性信号分布面积

注：同一列肩注大写字母表示差异极显著性(P<0.01)，同一列肩注小写字母表示差异显著性(P<0.05)。

3 讨论与结论

3.1 不同日龄五指山猪胰腺的组织学特点

试验在40 d五指山猪的胰腺中便观察到胰岛，且轮廓清晰，与靳二辉[9]所述的40 d猪的胰腺中胰岛轮廓不清晰相反。但是胰岛的面积会随着日龄的增加而增大，与靳二辉的结果一致；五指山猪在40和120 d胰腺小叶间有较多量脂肪沉积，而在其他日龄猪胰腺中未观察到，需要进一步探究其发生原因。

3.2 不同日龄五指山猪胰腺胰岛主要构成细胞分布特点

胰岛可在小鼠胚胎的第12天确认，但外分泌部未发育完全，在胚胎第16天才能确认，在生后30 d左右胰岛结构才能基本完善[6-9]。其中，在胚胎的第11～12天可见胰岛A细胞和B细胞，第14天可见D细胞，由此可知，胰岛细胞的分化早于外分泌部[10-11]。目前为止，针对不同日龄动物胰岛细胞分布的研究，只是研究了B细胞，如Finegood[12]、Svenstrup等[6]研究发现，大鼠胰岛B细胞数量在4～16 d呈线性增加，其B细胞数量在16～24 d达到平台期，然后进一步增加到成年的胰岛数量；Bock等[13]研究发现，猪胰腺胰岛在5～40 d B细胞数量呈线性增加，在40～60 d达到平衡，60 d后细胞数量会随体重的变化而发生改变，直至增加到成年胰岛数量。从中可以看出，在胚后发育过程中，动物胰岛细胞数量变化历程相似。本试验结果与其变化相同。此外，本试验发现胰岛A细胞、D细胞的数量也有着相同的变化趋势。且通过试验结果可知，五指山猪的胰岛在出生早期，总是处于分化的阶段。并且，有相关研究发现，幼稚的胰腺内分泌细胞可以同时分泌数种激素，但是会随着发育而逐渐趋向成熟，这些细胞增殖能力也会逐渐的下降，所分泌激素也会逐渐趋向单一[13-17]。试验中120和180 d五指山猪的胰岛细胞也有相同的变化。因此，可以得出结论，180 d以前的五指山猪的胰岛B细胞也具有增殖分化的能力。

通过Buggenhout[18]的研究和刁红艳[19]的分析可知，幼年胰岛营养物质丰富，较其他年龄段胰岛更加稳定，在进行移植时应该选择胰岛细胞已经分化或者已趋向成熟的胚胎胰腺作为供体。因此，40 d左右五指山猪的胰腺最适合作为胰腺的异种移植。