广东沿海两地海水鱼总汞与甲基汞的相关性分析

陈霄，张文凤，黄伟雄，杨杏芬，耿予欢

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）（2.广东省疾病预防控制中心，广东广州 511430）

汞是一种对人类和其他动植物都具有相当大毒害作用的重金属元素，对神经系统、肾和肝脏等可产生不可逆的损害作用[1]，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）把汞列为十大引起重大公共健康问题的化学物质之一[2]，一旦汞被生物体吸收并沿食物链传递，就会对生命安全造成极大的威胁。甲基汞和无机汞对日本鹌鹑鸟的口服半数致死剂量（median lethal dose，LD50）分别为18 mg/kg和42 mg/kg[3]。汞在人体内的半衰期为60～120 d，在鱼体中的半衰期可以长达2年，鱼类是食物的主要污染物之一[4]。

欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）的相关研究结果表明，在人们的日常食品中，海水鱼是汞污染程度最严重的一类动物源食品[5]。世界各国对鱼类总汞和甲基汞含量都有着严格的限量标准，并且随着研究的逐步深入，各组织对食品中汞的限量标准和健康指导值也在不断修订中。我国对食品中汞含量的限量值依次经过GB 2762-1994（鱼类总汞≤0.3 mg/kg，甲基汞≤0.2 mg/kg）、GB 2762-2005（鱼类甲基汞≤0.5 mg/kg，食肉鱼类甲基汞≤1.0 mg/kg）、GB 2762-2012（水产动物及其制品甲基汞≤0.5 mg/kg，肉食性鱼类及其制品甲基汞≤1.0 mg/kg）和 GB 2762-2017[6]（与GB 2762-2012汞限量保持一致）的改变。根据人体的毒理学实验和流行病学数据统计结果，美国环保局（United States Environmental Protection Agency，USEPA）设定的甲基汞的每日可耐受限值（口服参考剂量）为0.1 μg/kg bw，而联合国粮农组织与世界卫生组织联合食品专家委员会（JECFA）设定的人体对甲基汞的暂定每周可耐受剂量的限值为 1.6 μg/kg bw[7]，这些限值对人群经膳食摄入甲基汞起到了一定的健康指导作用。

汞在鱼类等水生生物中主要以甲基汞的形态存在[5]。甲基汞是毒性最大、最易通过食物链积累、传递和生物放大的汞形态。鱼类汞浓度的高低还能够客观地反映当地海域环境受汞污染的水平。但是，由于水生生物可以富集水中的甲基汞，其体内甲基汞的含量可达到环境水体的104～106倍[8]，继而通过食物链的生物放大作用[9,10]，最终传递反馈给人类。甲基汞在人体肠道内能迅速吸收分并布到全身，进而侵犯中枢神经系统[11]，从而危害人体健康。食用海洋鱼类是沿海居民体内汞的主要暴露途径[12,13]，因此，本研究旨在以华南沿海两个有代表性的渔村为研究区域，针对当地主产海水鱼品种对其汞形态的分布特征进行描述和分析，研究海水鱼总汞和甲基汞含量比例的特异性，拟为日后的风险监测提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集、运输与保存

1.1.1 海水鱼采样方案的设计

（1）确定重点海水鱼品种。于2016年9～10月在粤西（湛江）和粤东（汕尾）各选取一个渔村作为研究区域，按照当地海水鱼产量统计来确定样品代表性，对当地渔民和普通人群开展问卷调查和入户调查，从而由海水鱼产量的高低排序确定重点采集品种。

（2）样品采集。经调查统计，确定重点海水鱼品种为20种。于2016年11月在研究区域当地的农贸市场、水产品批发市场、渔港市场等流通环节，采集了卵形鲳鲹、多鳞鱚和黄鳍鲷等20种共133尾海鱼，其中，粤东82尾，粤西51尾（详情见表1）。

表1 海水鱼信息表Table 1 Information of the 20 species of marine fish involved in this study

注：a样品来自粤西地区流通环节；b样品来自粤东地区流通环节；c信息来源于网站 http∶//fishbase.cn/；d信息来源于网站http∶//www.fao.org/。

1.1.2 海水鱼样品运输、预处理和保存

海水鱼样品在0 ℃下冷链运输至实验室，洗净样品后，取其肌肉组织（＞100 g/份），匀浆，分装于塑料瓶或密实袋中，添加标签，-20 ℃保存[14]。1个月内完成样品预处理及相关目标物的检测。

1.2 仪器设备与试剂

DMA-80直接测汞仪，意大利Milestone公司；液相色谱-在线紫外消解-原子荧光光谱联用仪（HPLC-online UV reduction-AFS），北京普析通用仪器有限公司；台式高速冷冻离心机，德国Sigma公司；超声波清洗机，德国 Elma公司；超纯水处理系统，美国Millipore公司；电子天平，瑞士Mettler Toledo公司。

汞标准液（1000 μg/mL），中国计量科学研究院；甲基汞标准液（63.6 μg/mL），中国计量科学研究院；鱼蛋白标准物质（DORM-4，总汞0.412±0.036 mg/kg，甲基汞 0.355±0.028 mg/kg），加拿大国家研究院；金枪鱼肌肉组织标准物质（ERM-CE464，总汞5.24±0.10 mg/kg，甲基汞5.50±0.17 mg/kg），欧洲委员会联合研究中心；硝酸（HPLC级），德国 Merck公司；甲醇（HPLC级），德国Merck公司；L-半胱氨酸（＞98.0%），上海阿拉丁生化科技有限公司；盐酸（优级纯），广州化学试剂厂；乙酸铵、氢氧化钾、硼氢化钾、氢氧化钠等固体药品（优级纯），天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.3 海水鱼样品总汞的测定

使用DMA-80直接测汞仪测定海水鱼样品总汞的含量。为扣除背景干扰，样品舟空载时的信号响应值(即吸光度值)不高于 0.0005。准确称量 0.2 g(精确到0.0001 g)海水鱼组织于样品舟(镍舟)中，置于DMA-80直接测汞仪进行总汞的测定，每个样品平行测定三次，该方法测得的值为汞的绝对值。

1.4 海水鱼样品甲基汞的测定

参考《食品中总汞及有机汞的测定》[15]中的食品中甲基汞的测定方法，并稍作改变，测定海水鱼样品甲基汞的含量。准确称量1.0 g(精确到0.0001 g)海水鱼组织于15 mL离心管中，加入10 mL 5 mol/L HCl，超声辅助萃取60 min，于4 ℃下8000 r/min冷冻离心15 min，取上清液2 mL于5 mL刻度试管中，滴加6 mol/L NaOH溶液将pH调至2～7，加入10 g/L L-半胱氨酸溶液0.10 mL，用超纯水定容至5 mL，上机测试前用0.22 μm水系滤膜过滤，每个样品平行测定三次。

HPLC-online UV reduction-AFS联机测样时的工作参数：(1)HPLC 条件：普析 C18 (4.6×150 mm，5 μm)；流动相60 mmol/L乙酸铵溶液(含5%甲醇和1g/L L-半胱氨酸)，流速 1.0 mL/min；进样量 100 μL。(2)online UV reduction条件：紫外灯开；泵速调至40 r/min；载流10%盐酸溶液；氧化剂为水；还原剂0.5%氢氧化钾+0.2%硼氢化钾混合溶液。(3)AFS工作参数：负高压270 V；总电流60 mA；氩气作为载气和屏蔽气，流量分别为300和500 mL/min。

1.5 数据统计分析

数据表达采用均数（±标准偏差，即±SD），运用SPSS22和Excel 2013作为统计分析软件，数据之间的差异采用非参数检验（Kolmogorov-Smirnov test和Mann-Whitney test等），以p＜0.05作为具有统计学差异的判断标准，以相关系数表示海水鱼总汞含量与甲基汞占总汞比例之间的关联，鉴于测定的样品数量有限，用spearman相关参数r和p（双尾）来评估相关关系的显著性。采用Excel 2013或Origin 8.5软件绘制相关图表。

2 结果与分析

2.1 标准曲线与方法检出限

2.1.1 总汞标准曲线

将1000 μg/mL的汞标准液，用2%的硝酸逐级稀释成汞浓度分别为0.5、1、2、5、10、15、20 和25 ng/mL的标准系列，以及25、50、100、150、200、300、400和500 ng/mL的标准系列。以吸光度Y为纵坐标，汞含量X为横坐标，绘制0～25 ng/mL和25～500 ng/mL两条测定总汞的工作曲线，并计算相关系数R2。工作曲线的回归方程分别为Y=0.04427831X-0.00044677X2（R2=0.9999）、Y=9.256885e-4+8.129776e-4X-1.5061e-7X2（R2=0.9999）。以2%的硝酸为空白，进行10次空白分析，以3倍的空白相对标准偏差计算仪器的检出限，总汞的检出限为0.02 ng/mL，定量范围为0.02～500 ng/mL。

2.1.2 甲基汞标准曲线

将原浓度为63.6 μg/mL的甲基汞标准液用流动相60 mmol/L乙酸铵溶液（含5%甲醇和1 g/L L-半胱氨酸）逐级稀释，得到浓度为 0.5、1、2、3、4、5、6和7 ng/mL的标准系列，以峰面积Y为纵坐标，甲基汞浓度X为横坐标，绘制0～7 ng/mL测定甲基汞的标准曲线，线性回归方程为：Y=12651.047852X-663.160217（R2=0.9998）。以信噪比的3倍计算检出限，甲基汞的检出限为0.08 ng/mL，定量范围为0.08～100 ng/mL。

2.2 方法的准确度和精密度

本研究采用测定鱼蛋白标准物质 DORM-4和金枪鱼肌肉组织标准物质ERM-CE464两种生物标准参考物质的方法来反映方法的准确度和精密度，进行方法的质量控制，平行测定3个样品，甲基汞和总汞的测定结果见表 2。结果表明，采用此方法总汞和甲基汞的测定结果与标准参考值吻合，相对误差小于3%，样品测定值的相对标准偏差（RSD）小于 3%，说明了所选方法适用于当前样品总汞和甲基汞的测定，其结果准确可靠，精密度良好。

表2 标准参考物质测定结果Table 2 Results of standard reference materials

2.3 海水鱼总汞的含量分布特征分析

粤西某渔村和粤东某渔村海水鱼肌肉中总汞（T-Hg）含量的分布情况分别见图1和图2。由图1可以看出，粤西渔村海水鱼 T-Hg含量范围为11.32～156.00 ng/g，平均值（±SD）为53.84（±32.60）ng/g，中位值为49.95 ng/g，经K-W非参数检验，11种海水鱼的T-Hg含量存在显著差异（p=0.0001），同品种不同个体海水鱼 T-Hg含量均无显著差异（p＞0.05），这可能与同一时期所采集的同品种海水鱼的尺寸大小趋同有关。此外，海水鱼 T-Hg含量可能还与鱼龄、食性、生长环境等密切相关[16,17]。食性是影响汞在水生生物体内富集的主要因素之一[18]，不同食性鱼类汞浓度的差异主要是由食物源引起的[19]。经多独立样本的K-W检验（H检验），在这些海水鱼中，食性对粤西地区海水鱼总汞含量的影响是显著的（χ2=9.20，p=0.0100），并且海水鱼总汞含量按食性的大小排序为：肉食性鱼类（61.36±26.74 ng/g，N=32）＞杂食性鱼类（48.21±39.73 ng/g，N=19），但是样品量较少增加了这个排序的不确定度，并且海底环境也可能是这一排序的影响因素。有研究表明，经污染源排入水体中的汞主要沉积在底泥中[20]，致使生活在水体底层的鱼类接触到较高浓度的汞，底栖性鱼类鱼肉甲基汞含量与水体底泥汞含量呈明显正相关[21]，长期食用含汞沉积物的底栖动物更趋向于成为海底环境中甲基汞的归宿。因此，以藻类及小型底栖动物为主的杂食性鱼类如黄鳍鲷，要比肉食性鱼类如多鳞鱚、二长棘鲷等的总汞含量高。

图1 粤西海水鱼肌肉中总汞(T-Hg)的含量分布Fig.1 Total mercury(T-Hg) content in marine fish muscle from western Guangdong

由图2可以看出，粤东某渔村海水鱼T-Hg含量范围为 15.35～201.68 ng/g，平均值（±SD）为 72.32（±48.70） ng/g，中位值为59.33 ng/g，经K-W非参数检验，18种海水鱼 T-Hg含量存在显著差异（p=0.0000），除带鱼（p=0.0069）之外，同品种不同个体海水鱼T-Hg均无显著差异（p＞0.05），这可能与同一时期所采集的同品种海水鱼的尺寸大小趋同有关。其中，海鳗的T-Hg含量最高，达到201.68 ng/g。一般而言，食物链中肉食性鱼类的营养级较高，体内也更容易蓄积高浓度的汞[22,23]。带鱼和海鳗都属于凶猛肉食性鱼类，其体内汞含量受鱼龄的影响十分明显，相对于其他鱼类食物链等级较高，因此富集汞含量也较高，这一点与相关研究结论一致[24]。鱼体中的汞主要是通过食物摄取进入体内，而通过鱼腮上皮细胞从水中直接吸收的汞占鱼体汞含量的很少一部分[25]。鱼类体内汞的含量与食物种类及其能量转换效率密切相关[26,27]，因此，同一水体环境海水鱼汞含量的差异与其摄食习惯和生理特征有很大关系。经多独立样本的K-W检验（H检验），在这些海水鱼中，食性对粤东地区海水鱼总汞含量的影响是显著的（χ2=18.24，p=0.0001），并且该区域海水鱼总汞含量按食性的大小排序与粤西的一致：肉食性鱼类（81.21±48.98 ng/g，N=58）＞杂食性鱼类（69.51±47.59 ng/g，N=24），这一点也与相关研究结论一致[28]。

图2 粤东海水鱼肌肉中总汞(T-Hg)的含量分布Fig.2 Total mercury(T-Hg) content in marine fish muscle from eastern Guangdong

粤东和粤西两个渔村的海水鱼样品总汞含量均低于总汞限量较严格的欧盟标准 0.5 mg/kg，其中海鳗T-Hg含量最高，达到201.68 ng/g。经非参数检验，粤东和粤西两个渔村的海水鱼样品 T-Hg含量的总体分布无显著差异（Z=0.99，p=0.2795），其平均水平存在显著差异（Z=-2.00，p=0.0453），以粤东海水鱼总汞含量更高。

粤东和粤西两个渔村的相同海水鱼品种有卵形鲳鲹、多鳞鱚、黄鳍鲷、舌鳎、马鲛鱼、二长棘鲷、蓝圆鲹、鲻鱼和石斑鱼。对这9种海水鱼进行两独立样本的K-S检验。两地区的多鳞鱚T-Hg含量的差异有统计学意义（Z=-1.55，p=0.0453），两地区的鲻鱼T-Hg含量的差异有统计学意义（Z=-1.49，p=0.0235），其余均不具有统计学意义。这说明了多鳞鱚和鲻鱼两种海鱼的T-Hg含量表现出了地域差异。

2.4 海水鱼甲基汞占总汞的比值分布特征分析

图3 粤西海水鱼肌肉中甲基汞与总汞比值(MeHg/T-Hg)分布Fig.3 Proportion of MeHg to T-Hg (MeHg/T-Hg) in marine fish muscle from western Guangdong

粤西某渔村的海水鱼肌肉甲基汞（MeHg）与总汞（T-Hg）的比值分布情况见图3。该区域海水鱼MeHg含量范围为11.05～158.30 ng/g，平均值（±SD）为45.40（±31.86）ng/g，中位值为39.71 ng/g；该区域海水鱼中MeHg/T-Hg的比值范围为49.40%～99.80%，平均值（±SD）为83.39（±13.50）%，中位值为83.80%，该结果与浙江沿海海产品中汞形态的分布情况一致[29]。粤西11种不同品种海水鱼MeHg/T-Hg比值存在显著差异（p＜0.05）。

图4 粤东海水鱼肌肉中甲基汞与总汞比值(MeHg/T-Hg)分布Fig.4 Proportion of MeHg to T-Hg (MeHg/T-Hg) in marine fish muscle from eastern Guangdong

粤东某渔村的海水鱼肌肉MeHg与T-Hg比值的分布情况见图 4。该区域海水鱼 MeHg含量范围为8.32～200.20 ng/g，平均值（±SD）为52.69（±44.30）ng/g，中位值为40.22 ng/g；MeHg/T-Hg的比值范围为12.88%～99.27%，平均值（±SD）为72.93（±27.10）%，中位值为68.80%；其中，鲻鱼肌肉的MeHg/T-Hg比值最低，平均值（±SD）仅为17.70（±4.80）%。粤东18种不同品种海水鱼的MeHg/T-Hg的比值差异具有统计学意义（p＜0.05）。

粤西和粤东两个渔村的海水鱼 MeHg/T-Hg比值的总体分布差异具有统计学意义（Z=2.54，p=0.0000），其平均水平也有显著差异（Z=-3.18，p=0.0015），以粤西海水鱼MeHg/T-Hg比值更高。但是，将粤东和粤西两个渔村的海水鱼 MeHg/T-Hg比值的总体分布分别与正态分布（Normal）、均匀分布（Uniform）和指数分布（Exponential）等比较后发现，两个总体分布与这些分布均有显著差异（p＜0.05），未能确定海水鱼MeHg/T-Hg比值样本总体的分布类型。

粤东地区比粤西地区海水鱼 MeHg/T-Hg比值范围跨度更大，可能原因是鱼体内的汞形态分布情况可能存在地域差异[30～32]。本研究中，粤东地区采集的海水鱼体长跨度大，而随着鱼体长（鱼龄）的增大，MeHg在海水鱼中的百分含量也随之增大[24]。对粤东和粤西两个渔村相同的9种海水鱼进行两独立样本的K-S检验，发现两地区海水鱼MeHg/T-Hg比值的差异有统计学意义的品种有卵形鲳鲹（Z=-1.60，p=0.0117）、舌鳎（Z=-1.41，p=0.0366）、马鲛鱼（Z=-1.55，p=0.0165）和鲻鱼（Z=-1.49，p=0.0235），其余 5种海水鱼均不具有统计学意义。这说明了卵形鲳鲹、舌鳎、马鲛鱼和鲻鱼这4种海水鱼的MeHg/T-Hg比值表现出了地域差异，暗示了鱼体汞形态分布情况存在地域差异现象。

2.5 海鱼T-Hg含量与MeHg/T-Hg比值的相关性分析

相关性分析结果表明，除了卵形鲳鲹（r=-0.6308，p=0.0156）、二长棘鲷（r=-0.7619，p=0.0280）和鲻鱼（r=-0.8333，p=0.0053）等3种海鱼，其余纳入统计的17种海水鱼的T-Hg含量与MeHg/T-Hg比值均不具有显著相关性（p＞0.05），说明了 MeHg/T-Hg比值可能在一定的范围内变化，但是不受总汞含量分布的影响。

3 结论

综上所述，运用 DMA80直接测汞仪法和HPLC-online UV reduction-AFS法测定粤东和粤西渔村海水鱼样品总汞和甲基汞的含量，结果表明：（1）甲基汞是海水鱼肌肉主要的汞形态，海水鱼肌肉MeHg/T-Hg比值接近80%；（2）两地区拥有T-Hg含量极大值的海水鱼为海鳗（201.68 ng/g），拥有MeHg含量极大值的海水鱼为蓝圆鲹（200.20 ng/g），鲻鱼肌肉的MeHg/T-Hg比值最低为17.70（±4.80）%，所有海水鱼样品MeHg含量均低于我国对食品甲基汞含量的限量值“鱼类≤0.5 mg/kg，肉食性鱼类≤1.0 mg/kg”；（3）两地区海水鱼总汞含量按食性的排序均呈现了以下规律：肉食性鱼类＞杂食性鱼类，并且该规律具有统计学意义；（4）海水鱼汞形态分布情况可能存在地域差异和品种差异。