高浓度二氧化碳气调包装通过调节酚代谢抑制鲜切莲藕的酶促褐变

谢君，代钰，王宏勋,3，易阳,3，侯温甫,3，艾有伟，闵婷

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉 430023）（2.武汉食品化妆品检验所，湖北武汉 430023）（3.湖北省生鲜食品工程技术研究中心，湖北武汉 430023）

莲藕（NelumbonuciferaG.）广泛种植在中国，是全球最受欢迎的蔬菜之一[1~3]。近来，随着消费者生活方式的改变，鲜切莲藕作为新型加工蔬菜受到越来越多的关注[4,5]。然而，鲜切产品质量下降的主要挑战是酶促褐变，酶促褐变会影响感官和质量，并限制了鲜切莲藕的保质期[6~8]。因此，了解如何延缓和防止酶促褐变是延长鲜切莲藕贮藏寿命的重要途径。

目前延缓鲜切果蔬褐变方法报道很多，包括化学处理，如有机酸[9,10]，亚硫酸盐[11]，过氧化氢[12]和电解水[13]，24-表油菜素内酯[14]和物理处理，如气调包装[15]，热处理[16]和低温储藏等[17]。其中气调包装在保持果蔬天然质量和延长保质期效果明显[18~21]，特别是高浓度的CO2MAP[8,22]。据报道，100% CO2MAP结合抗褐变处理和热处理延长鲜切莲藕保质期效果良好[8]。邢等[23]的研究结果表明，化学浸渍，肉桂油熏蒸和中度真空包装显著降低了鲜切莲藕褐变。

莲藕的褐变诱因主要表现为酶促褐变[24]。其中PAL是苯丙烷类物质代谢中第一个关键酶，负责合成酚类、木质素和花青素的前体物质，其中形成的酚为果蔬酶促褐变反应提供底物[25]，PAL基因参与鲜切果蔬的褐变已有报道。PPO是植物体内普遍存在的一种氧化还原酶，是引起果蔬酶促褐变最关键的酚酶之一[26]，PPO作为果蔬酶促褐变最关键基因已在较多果蔬中被分离鉴定，包括甘薯和荔枝等。POD是广泛存在于植物中的一种氧化还原酶，在H2O2存在的情况下，能将酚类物质和类黄酮氧化聚合形成褐色物质参与果蔬酶促褐变[27]。Xu等研究发现蝴蝶兰中PhPOD基因上调是导致其组织培养中外植体褐变的主要原因[28]。由此可见，PAL、PPO和POD可能在果蔬褐变中起着重要作用。

前人研究报道了PAL，PPO和POD基因参与果蔬褐变[15,29]。我们前期研究结果表明NnPAL1，NnPPOA，NnPOD1-6是高温诱导下鲜切莲藕褐变的候选基因[17]。然而，高浓度CO2MAP对鲜切莲藕PAL，PPO和POD酶及其编码基因的影响鲜有报道。为了进一步阐明高浓度CO2MAP抑制鲜切莲藕酶促褐变的机理，本研究采用高浓度CO2MAP对鲜切莲藕在贮藏过程中褐变度，总酚含量，PAL，PPO和POD酶活性及基因进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜莲藕（鄂莲五号），采于武汉汉口北四季美农贸批发市场。

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙醇、福林酚、无水碳酸钠、没食子酸、邻苯二酚、愈创木酚、H2O2、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮，国药集团化学试剂有限公司；Trition X-100，biosharp生物科技有限公司；苯丙氨酸解氨酶测定试剂盒，南京建成科技有限公司。

1.2 仪器与设备

CP214（C）型电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；V-1100D紫外分光光度计，上海美普达仪器有限公司；GL-20G-Ⅱ离心机，上海安亭科学仪器厂；IMS-20雪科制冰机，常熟市雪科电器有限公司；XHF-D高速分散器，宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-S2数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；DHG-9123A电热鼓风干燥箱、DHP-9082型电热恒温培养箱，上海恒一科学仪器有限公司；HYC-326A医用冷藏箱，青岛海尔特种电器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；A360型紫外可见分光光度计，翱艺仪器（上海）有限公司；气调包装机成套设备，上海福帝包装机械有限公司；FHW-450型保鲜膜封接机，浙江江南实业有限公司；MIR-154型低温贮藏箱，日本三洋。DYCP-31DN电泳仪，北京市六一仪器厂；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化；T100 TM Thermal Cycler PCR仪，美国伯乐；CFX96荧光PCR仪，美国伯乐；凝胶成像系统，美国伯乐。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

莲藕（鄂莲五号）从商业池塘（汉口北，武汉）购买，然后运送到实验室。莲藕的尺寸和地面颜色均匀，并且没有缺陷和机械损伤。处理前，莲藕在4 ℃保存24 h。用自来水冲洗莲藕以除去土壤并去皮。然后使用锋利的不锈钢刀将它们沿着莲藕的横截面切成5 mm厚的切片。转入清水中浸泡2 min后，将这些鲜切莲藕切片用滤纸吸干水分，进行不同 MAP（100%CO2和空气），每盒两片，分别转入冰箱（4 ℃，20 ℃）中。

所有处理均进行三次重复。样品在液氮中冷冻，储存于-80 ℃进一步使用。

1.3.2 褐变度的测定

参考以前的文献测定褐变度[17]，4 ℃下，用30 mL蒸馏水将3.0 g肉组织匀浆，在4 ℃下以10,000 g离心5 min。收集上清液，在25 ℃水浴中保温5 min。使用分光光度计在 410 nm测量吸光度，褐变度表示为A410×10。

《论语》中的恕和忠关系紧密，常以忠恕并提或并列。忠恕的目的是仁，是仁的内容，行恕的目的是体现忠。《论语》指出：“子曰：‘参乎！吾道一以贯之’。曾子曰：‘唯’。子出，门人问曰：‘何谓也？’曾子曰：‘夫子之道忠恕而已矣’。”其意是指，孔子讲：“曾参呀！我的学说贯穿着一个基本思想。”曾子说：“是的。”孔子走了出去，别的学生问道：“这是什么意思呢？”曾子说：“先生的学说就是忠和恕罢了。”很清楚，忠恕已成为《论语》道德准则的核心内容。

1.3.3 总酚含量的测定

参考以前的文献测定总酚含量[17]，将3.0 g新鲜的肉组织样品用30 mL的60%乙醇匀浆，并以10,000 r/min离心5 min。将上清液（10 mL）用40 mL 60%乙醇稀释以进行下一次测量。将0.125 mL溶液和0.625 mL蒸馏水混合，然后加入0.125 mL福林酚试剂。充分混合后，将混合物在室温下静置3 min，然后加1.25 mL 7%NaCO3和1.0 mL蒸馏水H2O。在25 ℃水浴中避光静置90 min后，使用分光光度计测量在760 nm处的吸光度。使用没食子酸的标准曲线来量化总酚含量。结果表示为没食子酸当量/kg鲜重（mg/kg）。

1.3.4 PAL、PPO和POD酶活性的测定

PAL、PPO和POD酶的提取和活性测定按照以前的文献所述进行[17]。通过分光光度法将PAL酶活性单位（U）定义为每克鲜重每分钟吸光度值在290 nm变化0.1所需的酶量。一个单位（U）的PPO活性被定义为在420 nm处每分钟引起吸光度改变0.001所需的酶量。用分光光度法将POD酶活性单位（U）定义为在470 nm每分钟引起吸光度改变0.01所需的酶量。

1.3.5 RNA提取和CDNA合成

根据以前的文献制备总 RNA。TURBO Dnase（Ambion）被用于去除总RNA中污染的基因组DNA的痕迹。用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）进行cDNA合成[30]。

1.3.6 实时定量PCR

Min等文献描述了用于 PCR分析的寡核苷酸引物。根据以前的文献使用SsofastEvaGreenSupermix试剂盒（Bio-Rad）和CFX96荧光PCR进行实时PCR以进行基因表达研究[17]。

1.3.7 数据分析

使用Origin 8.0软件绘制图片；使用DPS7.05软件进行最小显著性差异（LSD）分析。

2 结果与分析

2.1 褐变度

不同的MAP（100% CO2和空气）用于鲜切莲藕切片贮藏研究。研究结果表明两种MAP在整个储存期间促进了不同程度的褐变(图1)。相比于对照，100%CO2MAP鲜切莲藕的褐变明显延缓，褐变度（BD）仅从0.260增加到0.346，而在贮藏35 d后的空气对照中，褐变程度（BD）到0.460。

BD作为果蔬褐变的主要指标用于评价其褐变情况。通过测定褐变度发现100%CO2MAP的褐变度值明显低于对照。因此，这一结果进一步证明了高浓度CO2能有效延缓鲜切莲藕褐变进程[8]。

图1 不同气调包装4 ℃贮藏鲜切莲藕褐变度Fig.1 BD value of modified atmosphere packaging fresh-cut lotus roots in 4 ℃

2.2 总酚含量

图2 不同气调包装4 ℃贮藏鲜切莲藕总酚含量Fig.2 Total phenol content of modified atmosphere packaging fresh-cut lotus roots in 4 ℃

如图2所示不同的MAP对贮藏期间鲜切莲藕总酚含量的影响明显不同。100%CO2MAP的样品中总酚含量没有明显变化，从第0 d的69.491 mg/kg到第35 d的67.101 mg/kg。但是空气组增长较快，从第0 d的69.491 mg/kg增加到第35 d的84.050 mg/kg。结果表明，高浓度的CO2MAP在贮藏期间延缓了总酚含量的增加，这与前期研究结果相一致[17]。

2.3 PAL、PPO和POD活性

如图3所示，贮藏期间两种不同MAP对PAL、PPO和 POD酶活性的影响均明显不同。两种不同MAP样品的PAL活性显示出不同程度的增加，从初始值为 5.363 U/g至第 35 d分别为 100%CO2组的11.418 U/g和空气组的 17.473 U/g。其中100%CO2MAP的样品PAL活性显示较慢的增长。

图3 不同气调包装4 ℃贮藏鲜切莲藕PAL、PPO和POD酶活性Fig.3 PAL, PPO and POD avtivity of modified atmosphere packaging fresh-cut lotus roots in 4 ℃

与PAL类似，两种不同MAP中样品的PPO活性显示不同程度的增加，从初始值为0.611 U/g至第35 d分别为 100%CO2组的 0.833 U/g和空气组的 1.311 U/g。在整个贮藏期间，100%CO2组样品的PPO活性增加缓慢。100%CO2样品的POD活性显示出轻微的变化，并保持较低的值，从第0 d的0.034 U/g到第35 d的0.078 U/g。然而，空气组中的POD活性迅速增加，从0.034 U/g至第35 d的0.144 U/g。与空气组对比，在整个贮藏期间，100% CO2组样品的POD活性增加较为缓慢。

前人研究报道了PAL，PPO和POD参与了鲜切莲藕的酶促褐变[18,31]。通过分析两种不同 MAP条件下PAL，PPO和POD酶活性的变化。结果表明在100%CO2组的样品中，PAL，PPO和POD活性的与贮藏过程中鲜切莲藕的褐变程度相一致，这一结果与前人报道相一致[32~34]。然而，也有一些不同的观点，Gao等[5]人发现100% O2处理的鲜切莲藕，其PPO活性最低，其褐变抑制效果最好，这可能是由于品种的差异所致。

2.4 NnPAL、NnPPO和NnPOD基因表达

图4 不同气调包装4 ℃贮藏鲜切莲藕中NnPAL、NnPPO、NnPOD基因表达分析Fig.4 NnPAL, NnPPO and NnPOD expression patterns in response to different modified atmosphere packaging in fresh-cut lotus root

如图4所示，2个NnPAL基因对两个不同的MAP响应不一样。NnPAL1的表达对气调包装特别敏感，在整个贮藏过程中，空气组被不断诱导，在35 d达到峰值，但100%CO2组在第21 d开始下调。NnPAL2的表达较为恒定，表达量较低。

NnPPO基因表现出相似的表达模式。空气包装的鲜切莲藕的NnPPOA基因在整个贮藏期间被持续诱导，但是在贮藏后期100%CO2组的NnPPOA的表达下调。然而，在两种不同MAP之间的NnPPOC表达没有发现明显差异。

在NnPOD基因家族中，与对照相比，NnPOD2和NnPOD3的表达分别下降了30多倍和280倍，并且与酶活性的变化相一致。在两种不同的MAP样品中NnPOD1和NnPOD4的表达均呈不同程度增加，其表达水平相对低于NnPOD2和NnPOD3。相比之下，100% CO2组在整个贮藏过程中NnPOD5和NnPOD6被持续诱导。与其他NnPOD基因不同，NnPOD7的表达无显著变化。

前期研究发现NnPAL，NnPPO和NnPOD参与莲藕的褐变[17]。本研究发现 100%CO2包装的鲜切莲藕的NnPAL1，NnPPOA和NnPOD2/3比其他基因家族成员下调更明显。据报道苹果和PbPAL1，PbPAL2和PbPPO1的梨中Md-PPO参与了组织褐变，其表达模式与高浓度 CO2MAP的表达模式相似[15,35]。此外，NnPAL1，NnPPOA和NnPOD2/3的表达变化与PAL，PPO和POD酶活性的变化并行发生。然而，我们前期的研究发现在高温下NnPAL1，NnPPOA和NnPOD1-6的上调与新鲜莲藕褐变度的增加相一致[17]。综合前期报道和目前结果，NnPAL1，NnPPOA和NnPOD2/3被认为是鲜切莲藕褐变的重要候选基因，有待进一步的功能分析。

3 结论

综上所述，本研究分析了两种不同MAP对鲜切莲藕的褐变度，总酚含量，PAL，PPO和POD酶活性及其编码基因表达的影响。结果表明，100%CO2MAP对延缓鲜切莲藕褐变效果明显。PAL，PPO和POD酶活性的变化与 100%CO2MAP贮藏的褐变程度相一致。此外，NnPAL1，NnPPOA和NnPOD2/3的表达变化与PAL，PPO和POD酶活性的变化以及褐变度相一致，说明高浓度CO2MAP可能通过下调NnPAL1，NnPPOA和NnPOD2/3的表达延缓鲜切莲藕褐变进程。