胃癌细胞表面ALDH1表达及ALDH1+细胞的“干性”鉴定*

王一，刘丹丹，向勇平，刘理金，姜伟，李锦毅

(武警总医院 1.临床教研室，2.医学实验中心，北京 100039)

ALDH1属于乙醛脱氢酶(ALDH)家族，是催化细胞内乙醛氧化为乙酸、视黄醇氧化为视黄酸的细胞溶质酶[1]。ALDH1是19种ALDH同型异构体中较重要的1个亚型。肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)是肿瘤中一小部分具有自我更新和分化潜能的细胞，具备干细胞和肿瘤细胞的特征[2]，肿瘤干细胞在急性髓性白血病中首次被发现[3]，之后在神经系统肿瘤、结肠癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌等肿瘤中发现肿瘤干细胞存在[4]。ALDH1高表达是CSC及正常干细胞的共同特征，2007年，GINESTIER等[5]首次利用ALDH1在乳腺癌组织中发现乳腺癌干细胞，之后ALDH1也被证明在其他实体瘤，如肺癌[6]、头颈部肿瘤[7]、膀胱癌[8]、卵巢癌[9]、结肠癌[10]中可用于肿瘤干细胞的分离和鉴定。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备

细胞系:MGC-803和MKN-45由中国协和医科大学细胞中心提供，BGC-823由中国人民解放军军事医学科学院提供。实验动物:BALB/c-nu小鼠，雌性，4周龄，购自中国医学科学院实验动物研究所。主要试剂:DMEM、RPMI 1640、DMEM/F12培养基、N2、B27购自美国Gibco公司，重组人表皮细胞生长因子(recombinant human epidermal growth factor,EGF)、重组人碱性成纤维生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,bFGF)购自美国Peprotech公司，胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司，胰酶、四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Amresco公司，青霉素、链霉素购自山东鲁抗医药股份有限公司，二甲基亚砜(DMSO)、氟尿嘧啶购自美国Sigma公司，结晶紫购自上海碧云天生物技术有限公司，Aldefluor试剂盒购自加拿大Stem Cell公司，普通和倒置光学显微镜(日本Nicon公司)，酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)，流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及ALDH1表达检测 MGC-803用含10%胎牛血清的DMEM培养液，BGC-823和MKN-45用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，以上细胞置于37℃、5% CO2培养箱内培养。MGC-803和BGC-823用0.25%胰酶消化传代，MKN-45用0.05%胰酶加0.02% EDTA消化传代。分选后的ALDH1+、ALDH1-细胞用无血清培养液(含0.5% N2、1% B27、20 ng/ml EGF及10 ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基)，置于37℃、5% CO2培养箱内培养。

选取对数生长期细胞，制备浓度为1×106个/ml单细胞悬液，实验组加入活化的Aldefluor试剂5 μl/ml，ALDH能将BAAA转化为绿色发光物BAA，通过专用通道分选带绿色荧光BAA细胞[11]；对照组加入特殊抑制剂DEAB 50 μl/ml，DEAB能抑制ALDH把BAAA转化为BAA，作为阴性对照。反应30 min。1 000 r/min离心5 min，弃上清液，Aldefluor缓冲液重悬，上机检测，检测前加碘化丙啶(PI)染色标记死亡细胞。

1.2.2 ALDH1+细胞分化(不对称分裂)能力检测MGC-803及分选得到ALDH1+细胞和ALDH1-细胞，以5×104个/ml接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液，37℃、5% CO2培养箱中培养。1周后流式细胞仪检测ALDH1+所占比例情况。

1.2.3 平板克隆实验 ALDH1+和ALDH1-细胞分别以200个细胞/孔接种于6孔板，用无血清培养液，置于37℃、5% CO2培养箱培养10～14 d，至细胞克隆超过50个细胞时结束培养，100%甲醇室温固定，结晶紫室温染色后流水冲洗染料，计数每孔克隆形成数。克隆形成率=每孔克隆形成数/每孔接种细胞数×100%。

1.2.4 耐药实验 分选获得的ALDH1+及ALDH1-细胞分为两组，两组分别以3×103个细胞/孔接种于96孔板，无血清培养液培养24 h后分别加入1 µg/ml、2、5、15和25 µg/ml的氟尿嘧啶，每个浓度设3～5个复孔，以不加药物的复孔为对照组，培养24 h后，MTT法检测各组OD值，以只加DMSO孔为调零孔。细胞生长抑制率=[1-(实验组平均OD值-调零孔OD值)/(对照组平均OD值-调零孔OD值)]×100%。

1.2.5 致瘤实验 ALDH1+及ALDH1-细胞，悬浮于PBS缓冲液与基质胶(1:1)混合液中，5×103细胞数量级的ALDH1+细胞及ALDH1-细胞皮下接种于BALB/c-nu小鼠，每组4只小鼠。观察出瘤情况，测量瘤体长短径，记录瘤体出现时间及个数。待瘤体直径超过1 cm时处死小鼠，取出瘤体测量体积，瘤体体积=1/2长径×短径×短径。取肿瘤组织进行病理学检查。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，组间比较用t检验，计数资料以频数(%)表示，率的比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌细胞系ALDH1+表达

流式细胞仪检测结果显示，胃癌细胞系MGC-803、BGC-823、MKN-45中ALDH1+表达比例为(13.00±1.34)%、(5.80±2.15)%及(36.5±5.4)%，见图1。

2.2 ALDH1+细胞不对称分裂能力

MGC-803细胞ALDH1+表达率为11.5%，分选出的ALDH1+、ALDH1-细胞培养1周后，ALDH1+表达率分别为21.2%和3.9%。ALDH1+细胞组培养后ALDH1+表达率下降至21.2%，表明ALDH1+细胞在生长过程中，通过不对称分裂分化ALDH1-细胞，形成异质性。ALDH1-细胞组也检测ALDH1+表达，可能是由于细胞的不均一性、培养条件和处于不同细胞周期等因素，所以ALDH1不可能一次就把所有干细胞都标记出来，分选后的细胞再次检测依然会有阳性细胞。见图2。

2.3 ALDH1+细胞体外克隆形成能力

平板克隆实验结果见图3，ALDH1+组克隆形成率为(42.63±0.63)%，ALDH1-组克隆形成率为(18.50±2.04)%，两组比较差异有统计学意义(t=33.597，P =0.000)。培养14 d后，ALDH1+组克隆形成数比ALDH1-组多；染色前分别在显微镜下观察到的ALDH1+和ALDH1-组的克隆球，ALDH1+组克隆球大于ALDH1-组，且前者的克隆球内细胞排列紧密，中心处尤为突出，后者细胞间排列疏松。见图4。

图1 胃癌细胞系ALDH1+活性表达

2.4 ALDH1+细胞耐药性

检测氟尿嘧啶对ALDH1+及ALDH1-细胞的生长抑制率，以生长抑制率反应细胞对药物的耐受性，即生长抑制率越低耐药性越强。氟尿嘧啶作用细胞，每种药物浓度下ALDH1+组与ALDH1-组，1 µg/ml:(6.12±4.19)% vs(14.74±7.51)%、2 µg/ml(16.4±2.89)% vs(34.95±9.7)%、5 µg/ml:(30.06±6.96)% vs(48.57±5.8)%、15 µg/ml:(48.25±4.35)% vs(60.15±9.45)%、25 µg/ml:(56.81±16.39)% vs(70.18±12.4)%，ALDH1+组生长抑制率均低于ALDH1-组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图5。

图2 MGC-803及ALDH1+、ALDH1-细胞培养后ALDH1+表达比例

图3 ALDH1+组及ALDH1-组克隆形成率

2.5 ALDH1+细胞致瘤能力

图4 平板克隆形成及克隆形态

致瘤实验结果见附表，接种5×103细胞，第10天ALDH1+组全部致瘤，致瘤率为100%，ALDH1-组致瘤率为25%，至实验结束时的致瘤率为50%；见图6。5×103ALDH1+细胞组肿瘤体积为(112.90±72.20)mm3，与ALDH1-细胞组(20.80±26.70)mm3比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。肿瘤经中国医学科学院肿瘤医院病理科鉴定为肿瘤组织，见图7。

图5 两组生长抑制率比较

附表 接种5×103个细胞数ALDH1+组和ALDH1-组小鼠成瘤数

图6 实验结束时瘤块

3 讨论

CSC被认为是肿瘤发生、演变、转移、复发的“种子”，大量研究证实CSC与放化疗耐受及患者预后差密切相关[12-13]。因此能否精确分离出肿瘤干细胞，用于肿瘤诊断和靶向治疗成为研究的热点和难点。目前常用肿瘤干细胞表面标志物来分离CSC，分为表面标志物和功能性标志物[14-15]，如胃癌干细胞表面标志物有CD44[16]、CD133[17]、OCT4等[18]。本实验验证ALDH1在胃癌细胞中的表达及是否可作为胃癌干细胞标志物。

本实验检测到胃癌细胞系MGC-803、BGC-823及MKN-45中有ALDH1+的活性表达。选取BGC-823分选出ALDH1+和ALDH1-细胞进行生物学特性观察。由ALDH1+组和ALDH1-组细胞含血清培养1周后ALDH1+的活性表达比例发现，ALDH1+组中ALDH1+细胞分化出ALDH1-细胞，分裂后的细胞中ALDH1+表达比例接近BGC-823亲本细胞。说明ALDH1+细胞具有不对称分裂能力。ALDH1-组细胞培养后也出现小部分ALDH1+细胞。考虑是由于细胞的不均一性、培养条件或处于不同细胞周期等因素，所以ALDH1不能一次就把ALDH1+细胞分选彻底。平板克隆实验结果表明ALDH1+细胞体外克隆能力强于ALDH1-细胞，表现出更强的自我更新能力。对化疗药物的耐药性是肿瘤干细胞的另一生物学特性，本实验通过经典化疗药氟尿嘧啶来体现对细胞的生长抑制率，不同药物浓度下，ALDH1+组生长抑制率均低于ALDH1-组，表明ALDH1+细胞的耐药性强于ALDH1-细胞。体外成瘤实验是验证肿瘤干细胞的金标准[2]。结果显示与ALDH1-细胞比较，ALDH1+细胞致瘤率高、出瘤时间早、瘤体大、生长速度快。

从分化潜能、克隆形成能力、耐药性及致瘤能力方面证实胃癌细胞系中ALDH1+细胞具有干细胞特性，可将ALDH1作为分选胃癌干细胞的标志物。研究发现[12]，肿瘤干细胞在肿瘤中占一小部分，仅占0.1%～1.0%。实验中3种胃癌细胞系ALDH1+表达均不低，尤其MKN-45。说明ALDH1作为标志物的特异性不强，可能存在与胃癌细胞共表达。提示需要对ALDH1+细胞进一步研究。本实验表明，ALDH1+在胃癌细胞中的表达及ALDH1+细胞的干细胞样特性。对胃癌干细胞的分选及基础研究有重大意义，对胃癌的诊断及靶向治疗提供新的思路和理论基础。