Caspase-3与肝癌细胞的凋亡研究

张 靓

（江西省九江市第一人民医院病理科，江西 九江 332000）

本课题以人体原发性肝癌作为研究对象，以关键蛋白酶Caspase-3作为切入点，分析Caspase-3在肝癌中的表达与肝癌细胞凋亡的相关性，阐明Caspase-3在肝癌细胞凋亡中作用及其机制，为肝癌的基础研究提供可靠的理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 样本资料：选取本院2009年1月至2014年12月开展手术切除治疗的原发性肝癌（HCC）患者87例，均行组织病理学确诊符合《原发性肝癌》（2013年）诊断标准[1]。男性65例，女性22例，年龄37～79岁，平均年龄（53.08±4.95）岁。Edmondson组织学分级：64例Ⅰ～Ⅱ级，23例Ⅲ～Ⅳ级。本次入选病例手术前均未实施免疫制剂、放疗、化疗。取癌组织87例（观察组），癌旁组织58例（对照组），取肝内胆管结石扩张胆管旁正常肝组织21例（参考组）。

1.2 方法：全部均为术中取新鲜组织样本，4%中性多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚组织切片。①Caspase-3表达：实施免疫组织化学（S-P）法检测，选用中杉金桥（北京）生产的S-P（SP9001）免疫组化染色试剂盒，按流程规范操作。②细胞凋亡：实施原位末端标记技术（TUNEL）法检测，选用博士德生物公司生产的POD细胞凋亡检测试剂盒（NK1020），按流程规范操作。

1.3 评价标准：Caspase-3表达结果判定：高倍镜（200倍）观察，细胞质、膜呈黄色颗粒为阳性，①阳性细胞着色：0分未着色，1分呈淡黄色，2分黄色，3分为棕黄色。②阳性细胞整体比例评估，0分：阳性细胞＜1.0%，1分：阳性细胞1%～10%，2分：阳性细胞11%～50%，3分：阳性细胞51%～80%，4分：阳性细胞＞80%。依据IRS法计算，将两项评分项目相之和作为判定结果，阴性（-）：0分，弱阳性（+）：1～4分，阳性（++）：5～8分，强阳性（+++）：9～12分。细胞凋亡结果判定：高倍镜（200倍）观察，细胞核呈黄色颗粒为阳性，属凋亡细胞；随机性抽选10个高倍视野进行细胞计数（800个肿瘤细胞），计算细胞凋亡指数（AI），其中AI计算方式为AI=凋亡细胞/800×100%。

1.4 统计学方法：数据纳入SPSS19.0软件分析，χ2、t检验，（P＜0.05）差异显著，有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组Caspase-3表达情况比较：经检测，观察组肝细胞内Caspase-3表达阳性率39.1%（34例），对照组肝细胞内Caspase-3表达阳性率70.7%（41例），参考组肝细胞内Caspase-3表达阳性率80.9%（17例），观察组Caspase-3表达阳性率与对照组（参考组）均有明显差异（P＜0.05）；对照组与参考组Caspase-3表达阳性率无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组Caspase-3表达情况比较[n（%）]

2.2 HCC肝癌Caspase-3表达与AI关系分析：将87例HCC患者按照Caspase-3表达结果进行分组，其中Caspase-3表达阳性组34例，Caspase-3表达阴性组53例，比较两组细胞凋亡指数变化，结果证实，Caspase-3表达阳性组与Caspase-3表达阴性组AI有明显差异性（P＜0.05），二者呈负相关（-0.924，P=0.001）。见表2。

表2 HCC肝癌Caspase-3表达与AI关系分析（±s）

表2 HCC肝癌Caspase-3表达与AI关系分析（±s）

组别 n AI(%)Caspase-3表达阳性组 34 5.67±3.79 Caspase-3表达阴性组 53 2.76±1.62 t 4.9418 P 0

3 讨 论

Caspase-3被认为是处于凋亡途径的核心环节和终末效应器酶，属关键蛋白酶。动物实验表明，缺乏Caspase-3小鼠表现为脑内细胞过度增生和细胞发育失去有序性。为此有学者指出，Caspase依赖的细胞凋亡相关肿瘤和疾病有可能作为临床治疗肿瘤的又一新靶点。研究证实[2]，Caspase-3在各类肿瘤及相关细胞系内均存在表达缺失现象，并与细胞凋亡抵抗现象及细胞对药性耐药抵抗有明显关联。如易娟等[3]检测乳腺癌Caspase-3表达情况，认为Caspase-3表达缺失将造成癌细胞凋亡抵抗；而白血病、宫颈癌、淋巴母细胞瘤等Caspase-3表达处于未激活状态，将限制癌细胞对各类化疗药物所诱导的凋亡效果，甚至发生化疗抵抗。夏钰弘等[4]研究通过原位杂交法对HCC患者Caspase-3表达检测，发现HCC肝细胞呈低表达，而健康肝组织细胞内Caspase-3表达阳性较高，由此推导HCC的病发可能与Caspase-3表达缺失有着关联。本研究结果亦证实，HCC病灶组织内Caspase-3表达阳性率与癌旁组织及正常肝组织均有明显差异；这一结果也与夏钰弘研究相符。证实Caspase-3表达缺失可造成肝癌细胞凋亡障碍，侧面反映了Caspase-3表达将诱导HCC癌细胞生长。

细胞凋亡主要经由基因控制的生物正常细胞自限性死亡特征，同时也是保障生物内环境调节稳定的机制。细胞凋亡是一个复杂过程，可受多种因素诱导所致，其中Caspase是细胞凋亡的中心环节，以蛋白底物裂解、细胞解体为结局，而Caspase-3则是细胞凋亡效应产生的初始执行者，重点对多个关键点进行酶切[5]。本研究比较HCC肝细胞Caspase-3表达阳性患与阴性表达细胞凋亡指数变化，结果证实Caspase-3表达阳性与Caspase-3表达阴性者在肝癌细胞内AI有明显差异性，二者呈负相关；表明Caspase-3能够影响HCC病变，对肝细胞凋亡产生直接的作用。

综上所述，Caspase-3表达缺失将造成肝癌细胞凋亡迟缓或紊乱，诱导HCC的病变及恶性进展。