鲣鱼内脏中鱼油对D-半乳糖制衰老模型小鼠抗衰老的影响

虞 舟，白 冬，张海玲，谢 超

（1.舟山昌国食品有限公司，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022；3.舟山富晟食品科技有限公司，浙江舟山 316025）

鲣鱼Katsuwonus pelamis，俗称炸弹鱼，属于金枪鱼科Thunnidae，其产量占金枪鱼渔业的40%[1-3]。鲣鱼蛋白质含量高，氨基酸比例合理，且种类丰富；胆固醇和脂肪含量低，而且DHA和EPA等多不饱和脂肪酸含量丰富，且ω-3多不饱和脂肪酸和矿物质元素含量丰富，氨基酸配比合理，符合现代人群健康饮食消费观念，是很好的蛋白质来源食品并且是便于人体吸收利用的健康食品[4-6]。高颐雄等[7]研究了舟山海域的31种海鱼中脂肪酸含量，发现扁舵鲣Auxis thazard的总脂肪高达13.2%且n-3多不饱和脂肪酸质量分数最高为2.62%。也有研究报道，金枪鱼和鲣鱼等大型洄游性鱼的内脏和眼窝中含有30%～40%二十二碳六烯酸（DHA）以及5%～10%的二十碳五烯酸（EPA）[8-9]。周敏等[10]测定了黄鳍金枪鱼Thunnus albacores眼窝油中DHA的含量为19.6 mg/g，占总脂肪含量的27.1%，比例较高，适用于DHA相关产品的开发。

衰老又称老化，是各生物所必然经历的一种过程，是生物在正常状况下发育成熟之后，机体各组织器官功能随时间的流逝而减退，自身应急免疫能力下降，内环境产生不稳定因素，各结构组分不可抗拒的退行变化的现象[11-13]。衰老不可逆转，但是可以干预延缓衰老[14-15]，保持机体具有足够的抗氧化物质，增加抗氧化酶活性，及时清除机体内过量的自由基，减缓其对细胞和组织的破坏，从而维持了细胞和组织的正常功能，达到保持机体健康和抗衰老的目的[16-17]。深海鱼油中富含DHA和EPA等多不饱和脂肪酸，对人体正常发育和保持健康有重要意义，还可预防和治疗多种疾病[18-19]，幼儿及青少年及时补充DHA和EPA，可促进其视力以及智力的发育，中老年人及时补充可预防延缓由衰老所带来的一系列疾病，如心脑血管疾病，高血压，高血脂，视力下降，老年痴呆等症状[20-22]。

目前鲣鱼肌肉营养成分的分析和评价与保鲜维持品质的研究报道较多，鲜有有关鲣鱼鱼油生物活性功能的评价，本文探讨深海鲣鱼鱼油对D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠抗衰老功能的影响，以期为鲣鱼油抗氧化、抗衰老能力提供新的理论数据，也为鲣鱼的综合开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

ICR小鼠，平均体质量在18～22 g，雄性，购于浙江省实验动物质量监督检测站。

鲣鱼鱼油由实验室提取、精制，DHA，EPA含量为45%，高于一般市售鱼油；D-半乳糖、冰醋酸，国药集团化学试剂有限公司出品；谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒、总超氧化物酶试剂盒、丙二醛测定试剂盒、过氧化物酶试剂盒，南京建成生物工程研究所生产；市售金枪鱼油，主要原料为金枪鱼油，维生素E，柠檬酸，其中DHA，EPA含量为29.6%，上海恒寿堂药业有限公司制造。

BT125D型电子天平，塞利多斯科学仪器有限公司生产；16K-M高速离心机，长沙鑫奥仪器仪表有限公司出品；THERMO酶标仪，上海辅泽商贸有限公司制造。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠分组

将小鼠（21±2 g）在清洁安静温度适宜的动物房适应性饲养，饲养条件：25±2℃，每12 h昼夜间断性照明。3 d后取出，随机分成6组，每组8只，即空白对照组（BC）；鲣鱼鱼油组：即低剂量组（LD）、中剂量组（MD）、高剂量组（HD）；D-半乳糖模型组（NC）；阳性对照组（PC、市售金枪鱼油）。

1.2.2 小鼠给药

采用皮下注射方式，给鲣鱼鱼油组、阳性对照组和D-半乳糖模型组每只小鼠每天注射浓度为的4%D-半乳糖（1 000 mg/kg），空白组小鼠每只每天注射等体积 0.9%的生理盐水，连续注射6周。注射4%D-半乳糖的同时,鲣鱼鱼油制剂组分别每天灌胃10mL/kg bw不同质量浓度的鱼油（20，50，100 mg/mL），阳性对照组灌胃市售鱼油（1 000 mg/kg），空白对照组和D-半乳糖模型组灌胃等体积生理盐水[23]。

1.2.3 灌胃方法

将小鼠用左手抓紧小鼠背部和头部的皮毛，使其固定，并使其头部后仰，与身体成一水平直线，将针头自口腔右侧沿上颚垂直缓慢下行，灌药，观察小鼠呼吸正常与否[24]。

1.2.4 组织处理及准备

（1）血清准备：采血前12 h禁食，采血1 h前禁水，选用眼球摘除采血法采血，立即4 000 r/min离心15min取血清，-80 ℃保存[25]。

（2）肝组织：脱颈处死小鼠后，剪开腹腔完整取出小鼠肝脏后用4℃生理盐水清洗，滤纸吸干，保存在Bouin氏固定液中，制作石蜡切片并进行HE染色观察肝脏组织病理变化情况。

（3）肝匀浆制备：脱颈处死小鼠后，剪开腹腔完整取出小鼠肝脏加入4℃预冷生理盐水制成10%的肝脏组织匀浆，低温离心机4℃3 000 r/min离心10～15min,取出上清液，加入生理盐水配置成实验所需的各浓度，4℃保存待测。

1.2.5 肝脾指数的测定

根据小鼠体重、肝脏重量以及脾脏重量计算出肝指数和脾指数，公式如下

1.2.6 生化指标的测定

测定GSH-Px，T-SOD，CAT活性以及MDA含量等指标，具体操作参照试剂盒说明书。

1.2.7 肝脏切片及HE染色

小鼠肝脏组织于Bouin氏固定液中固定24 h，取出修整，梯度乙醇脱水而后常规石蜡包埋，连续切3 μm厚切片，染色，脱水后封片，然后在光学电子显微镜下观察肝组织病理变化情况[26-27]。

1.2.8 数据处理

数据处理及作图采用Origin 8.1、SPSS 13.0统计分析软件，结果为平均值±标准偏差（采用SNK法分析测验显著性水平，P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 小鼠肝指数和脾指数

结果如图1和图2。

图1 各组小鼠的肝指数Fig.1 The liver index in different groups mice

图2 各组小鼠的脾指数Fig.2 The thymus index in different groups mice

如图1所示，与阴性对照组相比，鲣鱼鱼油中、高剂量组和空白对照组的肝指数呈明显下降趋势（P<0.05），低剂量组肝指数表现一定的下降趋势（P>0.05）。图2为各组小鼠的脾指数，鲣鱼鱼油高剂量组、空白对照组和阳性对照组与阴性对照组相比脾指数显著下降（P<0.05），低、中剂量组表现为下降趋势，但差异并不显著。结果表明鲣鱼鱼油可在一定程度上降低小鼠肝脾指数。

2.2 小鼠肝脏生化指标

通过大量试验证明，小鼠经D-半乳糖注射诱导可以导致其加速衰老，并且有类似于自然衰老的各种生理生化的老化表现[28-29]。表1所示为各组小鼠肝组织中生化指标的结果。与空白对照组相比，D-半乳糖模型组中GSH-Px，T-SOD以及CAT指标结果均降低，差异有显著性（P<0.01）。MDA含量显著升高（P<0.01），说明D-半乳糖致衰老型小鼠造模成功。与D-半乳糖模型组相比，鲣鱼鱼油各剂量组与阳性对照组均提升了肝匀浆GSH-Px，T-SOD以及CAT活性，差异性显著，且各指标随鲣鱼鱼油剂量的增加而升高，均降低了MDA的含量，差异有统计学意义。说明了鲣鱼鱼油能够提高肝组织GSH-Px，T-SOD以及CAT活性，降低MDA含量，有缓解衰老的效果且HD组的作用最为明显。这表示鲣鱼鱼油中不饱和脂肪酸有可能替代了机体内的还原物质，使其免受氧化而维持了正常的生理功能。

表1 鲣鱼鱼油对衰老小鼠肝匀浆中GSH-Px，T-SOD,CAT和 MDA的影响（x±s）Tab.1 Effects of skipjack tuna oil on liver homogenate SOD,GSHPx,T-AOC,CAT and MDA （x±s）

2.3 小鼠血液生化指标

表2为各组小鼠血清生化指标的结果。由表2可知，D-半乳糖模型组与空白对照组相比，血清中GSH-Px，T-SOD 活性显著下降（P<0.01），CAT 活性明显下降（P<0.05），MDA 含量显著上升（P<0.01），再次验证造模成功。与D-半乳糖模型组相比，高剂量组可显著提升GSH-Px，T-SOD和CAT活性（P<0.01）并降低 MDA 含量（P<0.01）；中剂量组能显著提高 GSH-Px活性（P<0.01），显著降低 MDA 含量（P<0.01）；阳性对照组能够显著提升GSH-Px活性（P<0.01），T-SOD和CAT活性升高明显（P<0.05），MDA含量显著下降。说明鲣鱼鱼油中高剂量组缓解衰老的效果与市售鱼油的效果相似，均可提升GSH-Px，T-SOD以及CAT活性，且使细胞中MDA含量下降到正常水平从而达到延缓衰老的作用。

表2 鲣鱼鱼油对衰老小鼠血清中GSH-Px,T-SOD,CAT和MDA的影响（x±s）Tab.2 Effects of skipjack tuna oil on serum SOD,GSH-Px,T-AOC,CAT and MDA （x±s）

2.4 小鼠肝脏组织切片观察分析

各组小鼠肝组织切片HE染色结果如图3所示。空白对照组小鼠中央静脉结构正常，呈较为规则的圆形，肝窦正常，肝索排列规范无异常，肝小叶和肝细胞结构正常；D-半乳糖模型组与空白对照组相比，肝索排列杂乱无序，肝窦扩张明显，肝小叶结构异常，肝细胞体积缩小，部分细胞可见双核；阳性对照组肝细胞体积较D-半乳糖模型组增大，肝小叶结构正常，肝索排列整齐规范，肝窦无明显扩张；HD组肝细胞大小与结构未见明显异常，肝小叶结构无异常，肝窦无扩张，肝索排列结构正常；MD组肝细胞结构正常，排列规范，肝窦未见明显扩张，肝小叶与肝索结构无异常；LD组部分肝细胞体积增大，出现双核细胞，肝索及肝窦结构未见明显异常[28～31]。

由此可见，鲣鱼鱼油可减缓细胞和组织结构的破坏，保护细胞以及组织功能正常，延缓衰老的进程。

3 结论

实验结果显示，D-半乳糖小鼠连续摄入鲣鱼鱼油6周后，小鼠体内抗氧化酶（GSH-Px，T-SOD以及CAT）活性得到显著提升，MDA含量明显下降，与NC组相比差异有显著性，且效果与鲣鱼鱼油摄入含量成正比。鲣鱼鱼油含有丰富的不饱和脂肪酸，特别是DHA和EPA，因此含有丰富的不饱和键，从而可代替生物机体完成正常代谢过程中的氧化环节，可有效的清除过量自由基，减少脂质过氧化物的产生，增强抗氧化酶活性进一步提升清除自由基的能力。同时，观察肝脏切片HE染色结果可知，相比于NC组，鲣鱼鱼油制剂组肝细胞大小与结构未见明显异常，肝小叶结构无异常，肝窦无扩张，肝索排列结构正常，HD组与空白对照组染色结果相似，效果较佳。

图3 小鼠各组肝组织切片HE染色结果（100×）Fig.3 Representative photography mangnification,×100 hematoxylin and eosin （HE）staining of liver in mice