挤压胁迫对三疣梭子蟹抗氧化和应激能力的影响

苏志星，何 杰，许文军，谢建军，施 慧，王庚申，汪 玮

（1.浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021）

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus，以下简称梭子蟹）隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、梭子蟹科、梭子蟹属，是我国重要的海水捕捞和养殖品种[1]。野生梭子蟹育肥暂养是从实践生产当中发展形成的一种高效利用野生梭子蟹自然资源的生产方式，其主要是利用捕捞旺季（9-11月）海区自然梭子蟹资源数量多、价格低之优势，使原本壳空肉瘦的梭子蟹经过一段时间的人工育肥暂养后而变得体肥膏满，最终实现产品品质和经济价值的有效提高[2]。然而，野生梭子蟹在育肥暂养前均需经历长时间的运输，而目前的运输方式多以蟹体堆叠式盛放为主，这难免致使梭子蟹在运输过程中受到不同程度的挤压胁迫。

大量研究表明，水生生物在环境因子胁迫下机体中的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽转移酶（GTS）、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、热休克蛋白（HSP70）等会呈规律性变化，这些生理指标已被广泛用于评估机体受环境胁迫的严重程度[3-7]。迄今为止，已有较多有关梭子蟹应对饥饿、重金属、氨氮、干露、高盐、低温等胁迫因子的生理响应规律研究[8-13]，而尚未见有关挤压胁迫对梭子蟹生理影响的报道。鉴于此，本研究将模拟野生梭子蟹的运输过程开展堆叠挤压胁迫对梭子蟹SOD、GTS、T-AOC等抗氧化和应激指标的影响，旨在分析堆叠挤压胁迫下梭子蟹的生理学变化规律，为评估堆叠挤压对梭子蟹的损伤程度以及为今后优化野生蟹的运输方法提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验于浙江省海洋水产研究所试验场进行。2016年7月下旬在梭子蟹养殖池塘去雄期间用饵料诱钓的方法捕捉、挑选十足完整、体质健壮、规格相近（体质量为80.15±8.96 g）的幼蟹800余只，暂养于室内水泥池内，水深40 cm，连续增氧，水温为27±1℃，光照周期为12 L：12 D，暂养期间，每天17：00投喂鲜活野杂鱼，投喂量约为蟹总重的8%，投喂2 h后清除残饵，并换水1/3，暂养3 d后开始正式试验。

1.2 方法

1.2.1 挤压处理

用橡皮筋逐个捆扎所有备用梭子蟹的螯足，以防止蟹与蟹之间相互撕咬。同时准备3只半径为20 cm，高为0.8 m的圆柱形塑料筐，模拟海捕蟹装筐运输的方式，将所有捆扎好的梭子蟹分层平铺于塑料筐中，每筐排列20层梭子蟹（依次为L1，L2，L3……L20，如图1所示），每层排列15只，再将塑料筐整体放入一水深为1 m的水泥池内，连续充氧。分别于实验起始后的0 h、12 h、24 h、36 h、48 h取样，每个时间点从每筐的 L1（无挤压）、L5（轻度挤压）、L10（中度挤压）、L15（较重度挤压）、L20（重度挤压）中随机各取1只蟹，用于解剖和生化分析。（补充说明：为方便取样，将每筐中的L2-L4、L6-L9、L11-L14、L16-L19 的蟹分别装于 4 个网袋内，L1、L5、L10、L15、L20 分别装于 5 个网袋内，每次以网袋为单位从塑料筐中存取，并从相应的网袋中采集样品蟹。）

图1 梭子蟹挤压排布示意图Fig.1 Diagram of extrusion arrangement of P.trituberculatus hepatopancreas

1.2.2 抗氧化和应激指标的测定

将样品蟹放在冰盘上冷冻麻醉，剥开蟹壳后迅速取出肝胰腺，并装入5mL的离心管后保存于-80℃超低温冰箱中，备用于检测抗氧化和应激指标。称取约0.2 g的肝胰腺，加入1mL（W/V=1:5）预冷的生理盐水后，用微型匀浆器匀浆30 s后在4℃，12 000 r/min条件下离心20min，取中间清液再次离心，取中间清液用于后续分析。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定肝胰腺中的超氧化歧化酶（SOD）活力、谷胱甘肽转移酶（GST）活力、总抗氧化（T-AOC）能力、丙二醛（MDA）含量以及热休克蛋白（HSP70）表达量。

1.3 数据分析

试验数据采用平均值±标准差表示，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，用Levene方法进行方差齐次性检测。当不满足使用齐性方差时进行反正弦或平方根处理，用T检验检查两群体各指标间的差异性，采用sigmaplot 10.0软件绘图，取P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 挤压胁迫对梭子蟹肝胰腺中SOD活力的影响

从图2可以看出，挤压胁迫处理后，蟹体肝胰腺中的SOD活力发生显著变化，总体表现为先升高后下降的趋势，且在挤压时间为36 h时达到最高。无挤压组、轻度挤压组组间和组内SOD活力不会随着处理时间的延长而表现显著性差异（P>0.05）；中度挤压组在挤压时间达到36 h时SOD活力与挤压前相比发生显著性变化（P<0.05）；较重度挤压实验组在挤压后第12 h SOD活力显著性升高（P<0.05），并在36 h达到最高，之后又恢复到挤压前水平（P>0.05）；重度挤压组在胁迫处理后SOD活力显著性升高（P<0.05），且在36 h达到最高，之后又有所下降。从图2还可以看出，相同挤压时间内受挤压程度较强的实验组与受挤压程度较轻组中SOD活力存在差异，前者大于后者，且在36 h时这种差异最为明显。

2.2 挤压胁迫对梭子蟹肝胰腺中GST活力的影响

挤压胁迫处理后蟹体肝胰腺中的GST活力变化明显（图3），总体表现出随着实验时间延长而升高的趋势，且在48 h时达到最高。无挤压组、轻度挤压组组间和组内GST活力随着挤压时间的延长无显著性差异（P>0.05）；较重度挤压组和重度挤压组中GST活力与挤压前变化显著（P<0.05），且在48 h活力达到最高。同时从图3中可以明显看出，相同挤压时间内，较重度挤压组、重度挤压组中GST活力明显高于无挤压组、轻度挤压组，且随着挤压时间的延长这种差异越明显（P<0.01）。

2.3 挤压胁迫对梭子蟹肝胰腺中T-AOC水平的影响

挤压胁迫导致蟹体肝胰腺中T-AOC水平变化显著（图4）。较低挤压强度下无挤压组、轻度挤压组中T-AOC水平随处理时间的延长有所升高但变化不明显（P>0.05），且各组之间无明显差异（P>0.05）。较重度挤压组、重度挤压组蟹体中T-AOC水平随挤压时间的延长发生显著性差异（P<0.01），总体表现出下降趋势，在36 h时达到最低，之后有所回升但与挤压前依然差异显著（P<0.05）。从图4可以看出，在挤压时间为36 h和48 h时，较重度挤压组、重度挤压组蟹体中T-AOC水平显著低于无挤压组、轻度挤压组（P<0.05），且T-AOC水平呈下降趋势。

图2 挤压胁迫对梭子蟹肝胰腺中SOD活力的影响Fig.2 Variations of SOD activities in P.trituberculatus hepatopancreas during extrusion-stress

图3 挤压胁迫对梭子蟹肝胰腺中GST活力的影响Fig.3 Variations of GST activities in P.trituberculatus hepatopancreas during extrusion-stress

2.4 挤压胁迫对梭子蟹肝胰腺中MDA含量的影响

挤压强度和挤压时间对蟹体肝胰腺中MDA含量有显著性影响（P<0.05）（图5）。无挤压组、轻度挤压组蟹体中各挤压时间段之间MDA含量没有发生明显变化，随着实验时间的延长MDA含量微弱增长；中度挤压组蟹体中MDA含量一直上升，在48 h达到最高；较重度挤压组、重度挤压组蟹体中MDA含量先上升后下降，在36 h时达到最高且与挤压前相比存在显著性差异（P<0.05），之后恢复到挤压前水平。从图5还可以看出，12 h、24 h、36 h中高挤压强度实验组MDA含量与低挤压强度组存在显著性差异（P<0.05），但在48 h后差异性消失（P>0.05）。

2.5 挤压胁迫对梭子蟹肝胰腺中HSP70表达量的影响

从图6可以看出，挤压强度和挤压时间对蟹体肝胰腺中HSP70表达量有显著影响（P<0.05）。无挤压组中HSP70表达量随着挤压时间先升高后降低，在24 h达到最高且与挤压前水平有显著差异（P<0.05），而轻度挤压组则先降低后升高，在48 h时达到最大且与挤压前存在显著性差异（P>0.05）；中度挤压组和较重度挤压组中HSP70表达量随着挤压时间的延长先上升后下降之后在上升，在48 h时表达量达到最大，与挤压前存在显著差异（P<0.05）；重度挤压组中HSP70表达量表现出先上升后下降的变化趋势，并在36 h时达到最大，与挤压前差异明显（P<0.05）。同时，在相同挤压时间内不同挤压强度组之间存在显著性差异（P<0.05）。

图4 挤压胁迫对梭子蟹肝胰腺中T-AOC的变化Fig.4 Variations of T-AOC level in P.trituberculatus hepatopancreas during extrusion-stress

图5 挤压胁迫对梭子蟹肝胰腺中MDA含量的影响Fig.5 Variations of MDA contents in P.trituberculatus hepatopancreas during extrusion-stress

图6 挤压胁迫对梭子蟹肝胰腺中HSP70表达量的影响Fig.6 Variations of HSP70 expression in P.trituberculatus hepatopancreas during extrusion-stress

大量研究表明，肝胰腺是梭子蟹主要的营养代谢和解毒器官，也是对外界胁迫刺激反应最早、最敏感的组织[11]；SOD是一种抗氧化酶，能够专一性的清除机体内的有害自由基，解除自由基氧化而造成的机体损害，维持机体内自由基的动态平衡，活性氧自由基（ROS）作为SOD的催化底物，二者的含量密切相关[11]。本研究发现，在挤压胁迫作用下蟹体肝胰腺中的SOD活力发生显著变化，总体上，除无挤压组外，其余各挤压强度组均表现出随着挤压程度的加强和挤压时间的延长，SOD活力呈现明显的先升高后降低的变化趋势，这可能是因为梭子蟹在挤压胁迫下代谢异常以致体内ROS急剧增多，引起机体的氧化应激，在自由基的诱导和机体的代偿应激下，SOD活力显著增高，即在0～36 h内各组SOD含量均显著上升，而随着机体内高浓度ROS对SOD的大量消耗和机体本身代偿应激的消失，SOD活力迅速回落到处理前水平，使得36 h后SOD活力呈现下降趋势，整体上与王丽等[9]、姜娜等[11]研究的干露和重金属胁迫对梭子蟹肝胰腺SOD活力影响的规律一致，说明这是梭子蟹应对环境胁迫时表现出共有的生理响应特征。

3 讨论

GST和SOD功能相似，都是一种抗氧化酶，其活力与SOD密切相关[14]。GST作为一种重要的解毒物质在肝脏中含量丰富，SOD可以将ROS转化成过氧化氢（H2O2），但H2O2对细胞依然具有强烈的氧化作用，而GST可以将H2O2催化分解为对机体无害的H2O，同时GST也可以清除机体内的自由基，将有毒的疏水化合物变成清水化合物排除体外[15]。在本研究中，在挤压胁迫作用下蟹体肝胰腺中GST活力随着挤压程度的加强和挤压时间的延长发生显著性差异，挤压时间越长GST活力越强，且GST活力与挤压强度与呈正相关，并与无挤压胁迫组有显著差异，表明在挤压胁迫下GST活性受到诱导而升高，从而提高消除大量H2O2对机体的毒害作用。

T-AOC代表了机体内总体抗氧化水平，分为酶性和非酶性两种。T-AOC可清除自由基和活性氧，其含量多少直接地反映机体的抗氧化酶活力高低，间接地反映出细胞受氧化损伤程度大小[16]。本研究中挤压胁迫作用下蟹体中T-AOC水平随挤压程度的加强和挤压时间的延长发生显著变化，在整个实验过程中轻度挤压组蟹体肝胰腺中T-AOC水平没有显著变化；在中度挤压组、较重度挤压组和重度挤压组蟹体肝胰腺中T-AOC水平均随挤压时间的延长而显著下降，在36 h后较稳定。这可能是因为轻度挤压胁迫组引起蟹体发生应激反应，机体内活性氧增高，肝胰腺组织反馈性的增强抗氧化酶系统的活力，以维持机体平衡，而高挤压强度胁迫超过了蟹体自身调控的阈值，抗氧化物质体系不断地被消耗。王丽等[9]在研究水体Cu2＋对三疣梭子蟹抗氧化能力的影响时也发现类似现象。

MDA是脂质被氧化后的终产物[4]，机体内MDA的含量间接反映出细胞受自由基的氧化损伤程度[17]。本研究发现，挤压胁迫下MDA含量随处理时间的延长发生显著变化，在0～36 h内轻度挤压组蟹体肝胰腺中MDA含量有所升高但变化不明显，而较重度挤压组与重度挤压组显著升高后下降，并且达到峰值的时间不同，重度挤压组和较重度挤压组在第36 h达到峰值，而重度挤压组的峰值出现于24 h，这说明挤压胁迫直接引起机体抗氧化防御系统的损伤，且随着挤压程度的加重和挤压时间的延长，“应激损伤”程度加剧。至于MDA含量在36 h后出现下降的的可能原因是蟹体对高挤压强度的逐渐适应，即“应激适应”。

HSP70作为生物体内一种灵敏的应激蛋白，其可以有效保护机体和细胞的功能，使机体免受不利因素的损伤，提高细胞对胁迫的耐受性[18]，其表达量变化直接反映出环境因子对生物机体的影响[5]。正常情况下HSP70在细胞中呈基础表达，表达水平很低，而在各种有害应激状态下HSP70合成速度剧增，可在极短的时间内达到峰值，以提高机体适应环境突变的能力。本研究发现，不同挤压强度胁迫对梭子蟹肝胰腺中HSP70表达量产生不同的影响，轻度挤压组蟹体肝胰腺中HSP70表达量表现出先下降后上升的趋势，在48 h时达到最大值，这可能是因为短时间的胁迫作用导致机体代谢异常和抗应激水平降低，而后通过生理适应机制恢复至正常水平[11]；中度挤压组和较重度挤压组蟹体肝胰腺中的HSP70表达量随挤压时间的延长表现出先升高后降低再升高的变化趋势，可能是在剧烈挤压胁迫环境下蟹体内短时间产生大量活性氧，活性氧使细胞内蛋白质变性，引发细胞程序性死亡，HSP70水平的提高可以阻断信号通路，抑制应激激酶的活性和蛋白质的变性，从而有效减少细胞的凋亡，显著改善细胞的生存能力，所以在挤压前期，为维持机体平衡，HSP70基因大量表达以消除活性氧对细胞的损害，随着挤压时间的延长，HSP70的大量存在又抑制了HSP70基因的表达，HSP70的表达量降低。

4 小结

综上，挤压胁迫将致使梭子蟹肝胰腺中的SOD、GST、T-AOC、MDA以及HSP70这5种指标呈现不同的变化趋势，并且变化规律受挤压程度的轻重以及挤压时间的长短等因素影响较大，呈现出明显的程度效应和时间效应，因此这些指标均能够较敏感地反映出胁迫时机体的生理状态，为今后优化野生蟹的运输方法提供了科学参考。