IGFBP-2、IL-8和CEA联合检测对结直肠癌的诊断价值*

顾静莉 李文娜 曹 勤 黄 融 马嘉骅 顾伟威 张庆华 范竹萍# 宋 凯

上海交通大学医学院附属仁济医院健康保健中心1(200127) 国家人类基因组南方研究中心上海市疾病与健康基因组学重点实验室2 上海华盈生物医药科技有限公司3

背景：结直肠癌的发病率和死亡率居高不下，早期诊断和治疗能提高整体生存率，血清肿瘤标记物的联合检测有望提高筛查效率。目的：探讨血清胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、白细胞介素8(IL-8)和癌胚抗原(CEA)三种肿瘤标记物联合检测对结直肠癌的诊断价值。方法：采用固相抗体芯片检测16例结直肠癌患者和16名正常人血清中13种肿瘤标记物的表达。以液相悬浮芯片进一步验证81例结直肠癌患者和14名正常人中高表达的肿瘤标记物。采用ROC曲线评价上述指标单项检测和联合检测对结直肠癌的诊断价值。结果：与正常人相比，结直肠癌患者血清IGFBP-2、IL-8和CEA表达显著升高(P<0.05)。这三项指标联合检测对结直肠癌的诊断敏感性为87.7%，特异性为92.9%， AUC为0.933，均高于单指标检测。结论：IGFBP-2、IL-8、CEA联合检测可提高结直肠癌的诊断效率，可作为临床诊断结直肠癌的辅助方法。

结直肠癌是当今最常见的疾病之一，死亡率位居恶性肿瘤第二位。全球每年约120万例患者被确诊为结直肠癌，超过50万例死于结直肠癌，结直肠癌已成为一个公共问题。虽然结直肠癌的诊断和治疗已取得较大的进展，但5年生存率仅50%，治疗效果仍有待提升[1-3]。早期诊断并及时治疗能提升结直肠癌整体的治疗效果和生存率，对延长患者生命、提高生存质量有重要意义。

内镜检查及其病理活检是目前诊断结直肠癌的主要方法[4-5]，但该法存在技术要求高、费用高、患者耐受性低等问题。粪便隐血试验是一种常用的结直肠癌诊断方法，然而其准确性并不理想[2]。血清肿瘤标记物检测具有操作简便快捷、非侵入性、检测样本易获得、成本低等优势，可作为筛查结直肠癌的有效手段，但目前仍缺乏诊断效率高的单项标记物。本研究利用固相抗体芯片对13个血清肿瘤标记物进行筛选，并进一步使用液相悬浮芯片对筛选出的指标进行验证，旨在探讨胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、白细胞介素8(IL-8)和癌胚抗原(CEA)联合诊断结直肠癌的价值。

材料与方法

一、检测对象

收集2016年9月—2017年3月上海交通大学医学院附属仁济医院收治的173例结直肠癌患者血清样本。临床确诊采用改良的Dukes分期，选用结直肠癌B、C、D期的患者血清样本。其中男103例，女70例，年龄19～91岁，平均57.5岁。以39名体检正常者血清样本作为对照，其中男22名，女17名，年龄19～69岁，平均40.23岁。

二、检测方法

1. 分离血清：采集空腹静脉血5 mL，静置，室温900×g离心10 min，分离血清，-80 ℃冰箱保存。

2. 固相抗体芯片实验：选取16例结直肠癌患者、16名正常人行固相抗体芯片实验。固相抗体芯片AAH-CUST(H13)委托美国Raybiotech公司定制。芯片上包含13种肿瘤标记物抗体：CEA、糖链抗原19-9(CA19-9)、CA15-3、血管内皮生长因子(VEGF)、血栓调节蛋白、IGFBP-2、脑源性神经生长因子(BDNF)、IL-8、IL-1ra、血清淀粉样蛋白A(SAA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、人脂质转运蛋白2、上皮细胞黏附分子1(TROP1)。芯片检测实验按照Raybiotech公司芯片配套提供的杂交标准流程进行。使用封闭液将芯片室温封闭30 min，选取50 μL 血清与50 μL封闭液混匀后与封闭后的芯片4 ℃ 杂交过夜。洗涤芯片后加入生物素标记的检测抗体，室温反应2 h后与链霉亲和素偶联的荧光染料室温反应2 h。洗涤芯片后甩干，使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描。

使用去除背景的荧光信号进行数据分析，荧光信号的强弱反映了该指标的表达情况。每种抗体设置两次技术重复，取均值。以Positive Control归一化样本间数据，并使用归一化后数据计算蛋白表达差异。

3. 液相悬浮芯片实验：选取157例结直肠癌患者、23名正常人行液相悬浮芯片实验。采用Bio-Plex MAGPIX System (Bio-Rad)液悬微珠芯片平台，芯片委托Millipore公司定制。使用HIGFBMAG-53K试剂盒检测IGFBP-2水平，HCCBP1MAG-58K试剂盒检测CEA、IL-8和VEGF水平。芯片检测实验按照Millipore公司芯片配套提供的杂交标准流程进行。反应孔中加入微珠，洗涤。加入样品，4 ℃避光孵育过夜。洗涤，加入生物素标记的检测抗体，室温避光孵育1 h。洗涤，加入藻红蛋白标记的链霉亲和素，室温避光孵育30 min。洗涤，送入已校正的液相悬浮芯片分析仪中读取结果。

使用去除空白对照的荧光信号进行数据分析，荧光信号的强弱反映了该指标的表达情况，根据标准曲线进行计算。

三、统计学分析

采用GraphPad Prism 5和Medcalc 15.2.2统计软件。两组间的比较采用独立样本t检验。联合诊断采用Logistic回归分析，以ROC曲线下面积(AUC)、敏感性和特异性评价指标的诊断价值。AUC的比较采用中数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、固相抗体芯片筛选差异表达的蛋白

固相抗体芯片结果显示结直肠癌患者血清IGFBP-2(P=0.016 7)、IL-8(P=0.013 6)、CEA(P=0.001 4)和VEGF(P=0.007 9)表达水平显著高于正常人(图1)。

二、液相悬浮芯片验证和评价高表达的指标

采用液相悬浮芯片对81例结直肠癌患者和14名正常人进一步检测血清IGFBP-2、IL-8、CEA和VEGF表达，结果显示结直肠癌患者血清IGFBP-2(P=0.015 3)和IL-8(P=0.005 7)表达显著高于正常人；81例结直肠癌患者中52例CEA表达高于正常人，但差异无统计学意义；而两组VEGF表达无明显差异(图2)。

ROC曲线分析显示，IGFBP-2单项检测诊断结直肠癌的敏感性为82.7%，特异性为92.9%，AUC为0.887；IL-8单项检测诊断结直肠癌的敏感性为86.4%，特异性为71.4%，AUC为0.852；CEA单项检测诊断结直肠癌的敏感性为37.0%，特异性为100%，AUC为0.698。IGFBP-2、IL-8和CEA联合检测诊断结直肠癌的敏感性为87.7%，特异性为92.9%，AUC为0.933(图3)。由此可见，与单项指标检测相比，三项指标联合检测可提高诊断结直肠癌的敏感性和特异性。

结合概率计算公式P=1/[1+e-Logit(P)]，采用交互点图(interactive dot diagram)分析得到概率阈值为0.739 1(图4)。若样本检测的概率>0.739 1，预测其为结直肠癌患者；反之，则预测其为非结直肠癌患者。

三、三项指标联合检测对结直肠癌的诊断效率

为检验这三项指标联合检测诊断结直肠癌的效率，使用液相悬浮芯片对76例结直肠癌患者和9名正常人血清IGFBP-2、IL-8和CEA水平进行检测。根据回归方程Logit(P)=-1.339 9+0.000 143 27×IGFBP-2+0.000 257 11×CEA+0.001 072 3×IL-8和概率计算公式预测每例入选者罹患结直肠癌的概率。结果显示对结直肠癌患者预判的准确率为80.3%(61/76)，正常人为100%(9/9)。

图1 结直肠癌患者和正常人血清中差异蛋白的表达(固相抗体芯片实验)

图2 液相悬浮芯片实验验证结直肠癌患者和正常人血清中差异表达的蛋白

图3IGFBP-2、IL-8和CEA单项检测和联合检测诊断结直肠癌的ROC曲线分析

图4 三项指标联合分析的预测概率阈值

讨 论

目前已发现的与结直肠癌相关的肿瘤标记物数目众多，但绝大多数均未能运用于临床诊断中。IGFBP-2、IL-8和CEA均属于肿瘤标记物[6]。人IGFBP-2含289个氨基酸，蛋白结构域包含保守的氨基端和羧基端区域[7]。有研究表明，IGFBP-2对包括结直肠癌在内的各种肿瘤均有促进作用[8]。IGFBP-2的Arg-Gly-Asp基序能与肿瘤细胞膜的整合素特异性结合，从而减少细胞间黏附，增加细胞的移动性[9]。此外，IGFBP-2入核后能通过激活VEGF来促进血管生成，从而产生致瘤作用[10-11]。IL-8是一种趋化因子。在正常人体内主要参与炎症和体内的免疫防御反应。有研究表明，IL-8可促进肿瘤的发生，而肿瘤细胞本身也可分泌IL-8，促进肿瘤 的生长和转移，如鼻咽癌[12]、肺癌[13]、乳腺癌[14]、结直肠癌[15]、肾癌[16]等恶性肿瘤中IL-8的基因表达升高，产生大量IL-8，参与构成肿瘤生存的微环境。CEA是一种蛋白多糖复合物，其大小根据糖基化程度的不同而有所差异，为180～200 kDa(1 Da=0.992 1 u)[17]。CEA通常由胎儿胃肠道产生，与细胞黏附相关。目前已广泛作为诊断结直肠癌的血清检测指标，但敏感性并不十分理想[18-21]。

蛋白芯片具有高通量、操作简单、所需样本量小的特点。本研究采用固相抗体芯片的检测方法，从13个肿瘤相关标记物中筛选出4项在结直肠癌中高表达的指标。随后增加样本量并采用液相悬浮芯片进行验证，确定结直肠癌中IGFBP-2、IL-8和CEA表达高于正常人。进一步通过ROC曲线和Logistic回归分析发现，与单指标检测相比，三项指标联合检测可提高诊断结直肠癌的敏感性和特异性；IGFBP-2、IL-8和CEA单项检测的AUC分别为0.887、0.852和0.698，而三项指标联合检测的AUC升至0.933。

本研究采用三项指标联合检测诊断结直肠癌，在保证较高特异性(92.9%)的同时具有较高的敏感性(87.7%)，是对目前临床诊断结直肠癌手段的一种补充，弥补了粪便隐血试验、内镜检查、单项肿瘤标记物诊断结直肠癌的不足，同时兼具肿瘤标记物检测所具备的操作简便快捷、非侵入性、检测样本易获得、成本低等优势，是一种易被接受的诊断方法。

本研究42例结直肠癌患者在临床检测了血清CEA、CA19-9、CA72-4、AFP和铁蛋白含量，分别有100%(42/42)、95.2%(40/42)、83.3%(35/42)、92.9%(39/42)和95.2%(40/42)处于临床认定的正常值范围内。说明临床上单独检测这些指标对诊断结直肠癌的敏感性太低。本研究通过联合检测CEA与IGFBP-2、IL-8，大大提高了诊断结直肠癌的敏感性，可作为临床诊断结直肠癌的辅助方法。

但本研究未对结直肠癌病例组进行分级分层分析，未在结直肠癌不同的病理阶段、病理类型中检测这三种肿瘤标记物的表达，以及联合检测的诊断意义。在行固相抗体芯片实验筛选相关肿瘤标记物时所纳入的样本量较少，未来可扩大样本量，进一步研究相关肿瘤标记物联合检测与结直肠癌之间的关系，使研究结果更精准。

综上所述，本研究发现，CEA与IGFBP-2、IL-8单项检测诊断结直肠癌的临床价值不高，但这三种肿瘤标记物联合检测可明显提高诊断结直肠癌的敏感性和特异性，可作为诊断结直肠癌的辅助方法。

致谢感谢上海东方医院叶勤、上海华盈生物医药科技有限公司周志强、计佳莉、梁丁芳、康林、张春秀等给予的帮助。