抗人TDP-43单克隆抗体的制备纯化及效价测定

吴绍长, 刘 奕, 申子好

(1. 丽水市第二人民医院, 丽水 323000; 2. 杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司， 杭州 310052)

交互反应DNA结合蛋白43 ku(Transactive response DNA-binding protein of 43 ku，TDP-43)是一个多功能的DNA和RNA结合蛋白，在细胞内的RNA转录、选择性剪接及mRNA稳定性调节等过程中发挥功能[1-3]。TDP-43和其它神经变性疾病相关的蛋白质现在被认为朊病毒，与多种神经退行性疾病相关，如额颞性痴呆(Frontotemporal Lobar degeneration，FTLD)、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)、Pick′s病、包涵体肌炎(Inclusion body myositis，IBM)、肌肉缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)[4-12]。本实验利用重组TDP-43蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤细胞技术，制备TDP-43单克隆抗体(简称单抗，McAb)，并进行纯化和效价测定，以期为建立TDP-43的检测、纯化方法以及开发相应的检测试剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

SPF级BALB/c 小鼠，雌性，6～8周及12周以上，购自浙江中医药大学动物实验室；NS-1骨髓瘤细胞由浙江大学细胞生物实验室提供；重组TDP-43蛋白由杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司提供。弗氏完全佐剂(Complete Freund′s Adjuvant，CFA)、弗氏不完全佐剂(incomplete Freund′s adjuvant，IFA)、蛋白A亲和层析柱、PEG 3000、PEG 20000、HT、HAT、RPMI-1640 培养基、HRP-羊抗鼠IgG、小鼠单抗分型试剂盒、Penicillin-Streptomycin均购自Sigma公司；新生牛血清购自Gibco公司；婴儿油购自强生公司。其余试剂为国产分析纯。

1.2 仪器

二氧化碳培养箱(日本三洋MCO-18AIC)；倒置生物显微镜(上海光学仪器厂37XE-PC)；净化工作台(苏州净化设备SW-CJ-1FD)；酶标仪(Tecan infinite F50)；紫外可见分光光度计(上海尤尼克仪器WFZ UV-2100)；离心机(长沙湘智离心机仪器TGL-20MB)；恒温振荡器(金坛市华城高尔实验仪器THZ-82)；洗板机(深圳市汇松科技PW-960)；精密电子天平(METILER TOLEDO AL104)；旋转混匀仪(北京大龙兴创实验仪器MX-RL-E)；磁力搅拌器(德国IKA RH B 2 S25)；pH计(上海仪电科学仪器PHS-3C)；电热恒温培养箱(上海博迅实业HPX-9082 MBE)；超低温冰箱(海尔DW-S6L388A)。

1.3 方法

1.3.1 制备杂交瘤细胞

1)免疫BALB/c 小鼠。

①第1次免疫：在100 μL 0.5 mg/mL 重组TDP-43蛋白中加入CFA 100 μL进行乳化，用上述乳化液免疫6～8周龄小鼠。

②第2次免疫：完成第1次免疫的2～3周后，在100 μL 0.5 mg/mL 重组TDP-43蛋白中加入IFA 100 μL进行乳化，用上述乳化液第2次免疫上述6～8周龄小鼠。

③第3次免疫：完成第2次免疫的2～3周后进行第3次免疫。方法同第2次免疫。第3次免疫完成后的第10天进行尾部静脉取血。

2)测定抗体滴度。用1 μg/mL的抗原溶液包被96孔酶标板；将1∶100的小鼠血清在96孔酶标板中进行倍比稀释，测定小鼠血清中的抗体滴度，筛选血清抗体滴度达到1∶10 000以上的小鼠用于的细胞融合。

3)细胞融合。取出免疫小鼠的脾脏，在无菌的组织培养皿中加入4 mL细胞培养液(含1.64%RPMI 1640、0.2% NaHCO3、1% Penicillin-streptomycin、10%灭活新生牛血清)，将脾脏放入上述组织培养皿中打碎；将NS-1骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞在50 mL离心管中按1∶10的比例混合后，1500 r/min离心5 min，去上清液后慢慢加入1 mL 50% PEG 3000；用RPMI1640培养基洗去PEG 3000；采用半胶质培养基克隆法筛选杂交瘤细胞；在96孔细胞培养板中培养杂交瘤细胞(37℃，5%CO2)；培养3 d后用间接ELISA 法筛选阳性生长的细胞克隆孔，有限稀释法进行克隆及亚克隆。

1.3.2 制备单克隆抗体

1)杂交瘤细胞的体内培养。对2只BALB/c小鼠(12周以上)的腹腔注射婴儿油(0.5 mL/只)；2周后腹腔注射杂交瘤细胞液1 mL/只，注射10 d左右可见小鼠腹腔明显变大，收集小鼠腹水。

2)单克隆抗体的纯化：将经过脱脂棉过滤后的小鼠腹水与等量的吸附缓冲液(pH 9.0)混匀，并加到已经经过吸附缓冲液(pH 9.0)预处理的蛋白A柱上，收集滤过液；将收集到的滤过液再次加到蛋白A柱上；用足够量的吸附缓冲液洗柱；在蛋白A柱上加上洗脱缓冲液(pH 3.0)，用一系列按顺序编好号的小试管(每个试管中加入200 μL 0.25 mol/L Na2PO4)收集洗脱液，每管收集约2 mL，测定每管收集到的洗脱液的蛋白含量，直到蛋白含量接近“0”时停止收集；将蛋白含量较多的试管中的洗脱液全部汇集到一起并混匀。

3)单克隆抗体浓缩。将纯化好的单抗溶液装入透析袋中，将吸水剂PEG 20000撒在透析袋周围，室温下静置4 h以上使溶液中的水分渗出；用Lowry 法测其蛋白浓度。

1.3.3 Ig类与亚类的鉴定

采用小鼠单抗分型试剂盒进行鉴定，操作步骤严格按照说明书进行。

1.3.4 单克隆抗体效价测定

将浓缩后的抗体按1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000稀释后，加入以重组TDP-43蛋白包被的酶标板中，通过间接ELISA 法测定其A450 nm值，以稀释度对A450 nm值画折线图，取A450 nm值为0.1时的稀释度为其效价。

2 结果

2.1 杂交瘤细胞的制备

杂交瘤细胞的抗体阳性检出率为8.33% (48/576)，选择其中较高读数的3株进行克隆和亚克隆，最终获得2株分泌抗TDP-43单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2A5和1C5。TDP-13的序列示意图如图1，2A5是针对TDP-43蛋白13～123位序列的单克隆抗体，可以检测TDP-43和TDP-35(图中86～414位)；1C5是针对TDP-43蛋白403～413位序列的单克隆抗体，可以检测TDP-43和TDP-35和TDP-25(图中的216～414位)。

图1 TDP-43序列示意图

2.2 Ig类/亚类的鉴定

经检测，2A5和1C5均为IgG1类免疫球蛋白(图2)。

图2 2株单抗的Ig分型

2.3 蛋白浓度和抗体效价

用Lowry 法测定1C5抗体浓度为1.5 mg/mL，2A5为2.0 mg/mL。

1C5抗体和2A5抗体的效价分别约为1∶256 000和1:512 000(表1)。

表1 2株抗人TDP-43单克隆抗体的效价测定

3 讨论与结论

TDP-43是一种主要在细胞核表达的DNA和RNA结合蛋白，由414个氨基酸组成，分子量约为43 ku[10-12]。TDP-43属于异种的核糖核蛋白家族，在细胞内的RNA转录、选择性剪接及mRNA稳定性调节等过程中发挥功能。在肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)和额颞叶变性(Frontotemporal lobar degeneration，FTLD)病人脊髓或大脑受损区域的神经元和胶质细胞中，能检测到泛素化的蛋白质包涵体，TDP-43是其特征性成分[12]。在家族性或散发性ALS病例中，已鉴定出30多个TDP-43的突变，它们多集中于该蛋白C端的甘氨酸富集区。到目前为止，TDP-43形成蛋白质聚集体的机制及其与神经退行疾病的关系尚不清楚。此外，TDP-43的病理学检查发现它还存在于很多其他神经退行性疾病中，包括tau病理相关疾病，如Pick′s病、阿尔兹海默症(Alzheimer′s disease, AD)等[4-12]。为了深入研究TDP-43蛋白在上述退行性疾病中的作用，本研究制备了抗人TDP-43单克隆抗体。

单克隆抗体具有高度均一、生物活性单一和与抗原结合的特异性强等优点，已经作为重要工具广泛应用于生物学、医学等领域[13-15]。本研究在传统的单克隆抗体制备过程中采用自行优化的半胶质培养基克隆法进行杂交瘤细胞的选择性培养，此方法避免了传统方法在选择性培养杂交瘤细胞时需要多次更换培养基的过程，简化了操作流程，并降低了操作过程中造成污染的风险。利用该技术成功制备出2株稳定分泌抗人TDP-43单克隆抗体细胞株1C5和2A5，其亚类均为IgG1。Kwong等[16]制备得到的18株抗人TDP-43单克隆抗体中有9株的亚类为IgG1，有8株的亚类为IgG2a，1株的亚类为IgG2b。通过间接ELISA鉴定，1C5抗体和2A5抗体的效价分别约为1∶256 000和1∶512 000，说明此两株单抗具有较高的生物活性，可用于检测TDP-43蛋白的各种免疫学方法的建立，为建立人TDP-43蛋白的检测、纯化方法以及开发相应的检测试剂奠定了基础。