凝血因子X 激活剂效价测定方法的建立及验证

崔亮亮，李秀琳，李秀娜，丁忠福，石皎，孙东，薛雁

作者单位：110171 沈阳，辽宁远大诺康生物制药有限公司

蛇毒中含有多种能够影响哺乳动物凝血系统的酶类，这些酶类与凝血机制级联放大反应中的各个凝血因子之间有比较严格的专一性作用，其中凝血因子 X 激活剂（coagulation factor X activator，FXA）是一种能够直接作用于凝血因子 X（coagulation factor X，FX）的具有蛋白水解酶特性的酶类，在蝰亚科、蝮亚科、眼镜蛇科等蛇毒中分布广泛[1]。人体正常的血液系统处于促凝-抗凝之间的动态平衡，当机体受到外源伤害或疾病干扰时，机体的凝血平衡被打破，启动凝血瀑布级联放大反应以抵抗外来因素的影响。然而无论是外源凝血途径还是内源凝血途径，最终均是凝血因子 FX 被激活为活化状态，即活化的凝血因子 X（coagulation factor X activated，FXa），FXa 激活凝血酶原生成凝血酶，发挥凝血作用[2]。巴西矛头蝮蛇蛇毒中分离得到的凝血因子 X 激活剂，为分子量 80000 D 左右的单一组分的糖蛋白，含有一条重链和两条轻链，具有钙离子依赖性。体外研究表明，在 Ca2+存在的条件下 FXA 可以特异性地水解 FX 生成 FXa，近而使人-枸橼酸血浆凝固[3-4]。体内试验研究表明，FXA 可明显缩短正常小鼠的断尾出血时间，具有较好的止血作用，鉴于 FXA 高度特异性作用特点，初步判断对 A 型血友病小鼠也会有较好的止血效果[5]，可缓解目前临床仅靠补充凝血因子 VIII 治疗 A 型血友病的局面，降低患者的经济负担，具有较好的药物经济学价值。

目前，根据作用底物的不同可将 FXA 的活性测定方法分为两大类：第一大类为天然底物法，即以人血浆为底物，以 FXA 加入血浆发生凝固的时间来进行 FXA 的活性测定。该法在 20 世纪 80 年代初得到普遍应用，方法常规[6]。第二大类为生色底物法，即通过 FXa 水解生色底物产生有特征吸收的生色产物进行的活性测定，又可分为二步法和FXA 外标法。二步法即在 FXA 作用于 FX 一段时间后加入终止剂，同时加入生色底物，根据特定时间内 FXa 的生成量计算 FXA 的活性[7]。FXA 外标法，通过检测 FXA 标准品不同浓度在 405 nm 处对硝基苯胺（pNA）的吸光度，绘制标准曲线计算待测样品效价。我们建立的方法是以 FX为反应底物，FXA 激活 FX 生成 FXa，FXa 水解生色底物生成在 405 nm 波长有最大吸收显黄色的对硝基苯胺，在FX 和生色底物足量的条件下，对硝基苯胺浓度仅与 FXA的活性相关且在一定的范围内具有线性相关性，依据 1 min内生成对硝基苯胺的物质的量计算 FXA 的活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 人源凝血因子 X 购自美国 Merck公司，批号：D00175389，1.4 mg/ml，119.4 U/mg；人凝血因子 X 购自 Hyphen BioMed 公司，批号：141104B，8 U/瓶；生色底物 S-2765（N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl，批号：N1143454，25 mg；Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl，批号：150410，10 mg）分别购自 Cheromogenix 和 Aglyco 公司；FXA 溶液购自辽宁远大诺康生物制药有限公司，批号：150107、150203、150406；Tris、HCl、CaCl2、EDTA、苯甲脒为国产分析纯。Evolvtion220 和 Lambda 35 型温控紫外分光光度仪分别购自 Thermo 和 Perkin Elmer 公司。

1.1.2 试剂配制 缓冲溶液 1：称取 Tris 1.210 g、NaCl 1.755 g、苯甲脒 0.031 g、CaCl20.111 g 溶于 80 ml 蒸馏水中，用 2 mol/L 的 HCl 溶液调 pH 到 7.5，定容至 100 ml。缓冲溶液 2：称取 Tris 12.1 g、NaCl 4.387 g、EDTA 1.861 g、溶于 80 ml 蒸馏水中，用 2 mol/L 的 HCl 溶液调 pH 到8.3，定容至 100 ml。缓冲溶液 3：称取 Tris 0.242 g、NaCl 0.585 g、苯甲脒 0.01557 g、溶于 80 ml 蒸馏水中，用 2 mol/L的 HCl 溶液调 pH 到 7.4，定容至 100 ml。稀释液：称取Tris 0.121 g，溶于 80 ml 蒸馏水中，用 2 mol/L 的 HCl 溶液调 pH 8.0，定容至 100 ml。生色底物 S-2765 溶液：用蒸馏水溶解，稀释至 1.5 mg/ml。FX 溶液：用缓冲溶液 3 将FX 溶液稀释至 1.25 U/ml。取 FXA 溶液，用稀释液稀释至适当浓度，作为供试品。

1.2 方法

1.2.1 实验过程 取供试品溶液、缓冲液 1、FX 溶液各200 μl 加至比色皿混匀，37 ℃ 温控紫外分光光度仪中保温 10 min，立即加入 200 μl 缓冲液 2、200 μl S-2765 溶液，混匀，37 ℃ 条件下，在 405 nm 处测定 0、1、2、3 min的吸收值A0、A1、A2、A3，A3–A0= ΔA，以供试品稀释液作为空白对照。供试品进行适量稀释，使测试的对硝基苯胺浓度为 0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min)，即 C 值为 0.1 ～0.2 μmol/(ml·min)。由公式计算 FXA 效价，重复测定 3 次，取平均值[8]。

t：测定时间（min）；Vt：反应总体积（ml）；10.4：对硝基苯胺摩尔吸光系数[ml/(μmol·cm)]；1：光程（cm）；Vs：FXA 供试品体积（ml）；n：FXA 供试品稀释倍数；ΔA=A3–A0。

1.2.2 FXA 单位定义 37 ℃，pH 8.0 条件下，1 min 内生成 1 μmol 对硝基苯胺需要的酶量定义为 1 单位的FXA[9]。

1.2.3 方法验证

1.2.3.1 范围 测定不同浓度的 FXA，确定对硝基苯胺浓度的可测量范围。

1.2.3.2 重复性 在测量范围内，重复 6 次测定同一批次FXA 活性。

1.2.3.3 中间精密度 在测量范围内，不同人员不同日期测定同一批次 FXA 活性。

1.2.3.4 耐用性 在测量范围内，分别采用不同厂家反应底物凝血因子 X（FX）、不同厂家生色底物（S-2765）、不同厂家紫外分光光度仪测定同一批次 FXA 活性。

1.2.3.5 回收率（准确性） 在测量范围内，测定供试品FXA 不同浓度的吸收值，制作标准曲线。计算曲线线性及理论效价，实测效价与理论效价比值为回收率。

1.2.3.6 稳定性 在测量范围内，测定 3 批次 FXA 活性，计算比活力。

表 1 FXA 测量范围确定结果

图 1 供试品稀释倍数的倒数与对硝基苯胺浓度的线性关系

表 2 重复性试验结果

表 3 精密度结果

2 结果

2.1 范围考察

供试品 150107 选择 6 个稀释倍数进行检测，对硝基苯胺的浓度范围确定结果如表 1 所示，近而限定 FXA 的最佳工作浓度范围。以供试品稀释倍数的倒数为横坐标，对硝基苯胺浓度为纵坐标，绘制曲线，结果见图 1。

由表 1 数据可以得出，将 FXA 稀释适宜浓度使生成的对硝基苯胺浓度在 0.042 ～ 0.274 μmol/(ml·min) 范围内，FXA 的效价稳定。范围线性方程为 y = 856.61x + 0.00162，r2= 0.99118，供试品稀释倍数的倒数与对硝基苯胺浓度线性关系良好。考虑 FXA 供试品稀释的适宜性，确定使生成的对硝基苯胺浓度在 0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范围内。

2.2 重复性

取供试品 150107 适宜稀释，使对硝基苯胺浓度在0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范围内，重复稀释测试 6 次，150107 的效价平均值为 875 U/ml，重复性 RSD 为 2.1%，结果见表 2。

2.3 中间精密度

取供试品 150107 适宜稀释，使对硝基苯胺浓度在0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范围内，不同人员不同时间进行测试，结果见表 3。150107 的效价平均值为 906 U/ml，精密度 RSD 为 2.8%。

2.4 耐用性

2.4.1 不同厂家 FX 测定 FXA 效价稳定性 取供试品 150107 适宜稀释，使对硝基苯胺浓度在 0.1 ～0.2 μmol/(ml·min) 的范围内，用不同厂家反应底物 FX 测定，结果见表 4。不同厂家的 FX 测试供试品效价分别为869 U/ml 和 771 U/ml，RSD 为 6.8%。

2.4.2 不同厂家 S-2765 测定 FXA 效价稳定性 取供试品 150107 适宜稀释，使对硝基苯胺浓度在 0.1 ～0.2 μmol/(ml·min) 的范围内，用不同厂家生色底物 S-2765测定效价，结果见表 5。不同厂家的 S-2765 测试供试品效价分别为 876 U/ml 和 860 U/ml，RSD 为 2.2%。

表 4 不同厂家 FX 测定结果

表 5 不同厂家 S-2765 测定结果

表 6 不同设备测定结果

表 7 线性及回收率结果

图 2 对硝基苯胺的线性曲线

表 8 3 批 FXA 的测定结果

2.4.3 不同型号仪器测定 FXA 效价稳定性 取供试品 150107 适宜稀释，使对硝基苯胺浓度在 0.1 ～0.2 μmol/(ml·min) 的范围内，用不同型号紫外分光光度计测定效价，结果见表 6。不同型号的仪器测试供试品效价分别为 869 和 897 U/ml，RSD 为 2.6%。

2.5 回收率

取供试品 150107 适宜稀释，使对硝基苯胺浓度在0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范围内，分别稀释 8333 倍、7143 倍、6250 倍、5000 倍、4000 倍，结果如表 7。以供试品稀释倍数的倒数为横坐标，对硝基苯胺浓度为纵坐标绘制曲线，结果见图 2。线性方程为 y = 848.13x + 0.001282，r2= 0.99356。将稀释倍数倒数带入标准曲线，计算理论效价，实测效价与理论效价比值为回收率，回收率平均值为100.2%，RSD 为 2.6%。

2.6 3 批 FXA 效价测定

取供试品 150107、150203、150406 分别适宜稀释，使对硝基苯胺浓度在 0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范围内，测定效价，结果见表 8。3 批供试品比活力均在 5500 U/mg左右。

3 讨论

3.1 温控紫外分光光度仪测定 FXA 效价方法的反应机制

FXA 水解 FX 生成 FXa，FXa 水解生色底物（S-2765）生成游离对硝基苯胺，呈黄色，在 λ = 405 nm 下有最大吸收。如果底物浓度足够大，能够使酶的活性中心全部饱和，则反应速度与底物浓度无关，而与酶活性中心的浓度成正比，在 FX 与 S-2765 均足量的条件下，对硝基苯胺的生成量与 FXA 的含量成正相关。37 ℃ 条件下，1 min 内生成 1 μmol 对硝基苯胺所需的酶量定义为 1 单位的 FXA。

3.2 温控紫外分光光度仪测定 FXA 效价方法的特点

20 世纪 80 年代初普遍应用的天然底物法以血浆为底物，需目测判断血浆凝固时间，受检测者主观干扰，并且不同厂家的人质控血浆和普通人枸橼酸血浆 FX 含量差异较大，从而导致 FXA 效价测试结果不一致。因此，近二十年文献多采用更加灵敏、可靠、稳定的生色底物法对 FXA进行检测[10]，生色底物法又分为二步法和 FXA 外标法。二步法需要引入 FXa 标准品，不能排除在活化的早期阶段和FXa 生成量之间可能存在的非线性关系，因而不能精确地反映 FXA 的活性作用特点[11]。FXA 外标法需提供 FXA标准品，而 FXA 标准品又以血浆为底物目测方法标定，同样会出现测试结果不稳定的问题。

本方法不用 FXA 和 FXa 标准品间接计算待测品效价，用单位时间内对硝基苯胺生成量定义 FXA 活性单位，减少测试过程中误差。在 0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范围内，供试品稀释倍数的倒数与对硝基苯胺浓度线性关系良好（r2≥ 0.99），从而验证方法中选择的反应底物 FX 浓度足量。检测过程中记录 0、1、2、3 min 的吸收值（405 nm），从而可验证反应中生色底物 S-2765 是否足量。在线性范围和 3 min 内满足底物 FX 和 S-2765 均过量条件下，该方法具有较好的线性、重复性、精密度和耐用性，能够准确、稳定、方便地测定 FXA 的效价。