生物环境中能提取到DNA吗

2018-08-15龚佐山

生物学教学 2018年12期

龚佐山

(安徽省六安市霍邱县第一中学六安 237400)

1 问题的由来

DNA的结构和DNA指导蛋白质的合成等是高中生物学教学的重要知识内容。根据DNA的分布，有核DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、端粒DNA；根据DNA的形状，可分为线状DNA、环状DNA、单链DNA、双链DNA；根据DNA的来源和作用，有cDNA、质粒DNA、探针DNA等。DNA主要分布在细胞核中或拟核中，储存着遗传信息，控制生物体或细胞的遗传和代谢。教材中“观察DNA和RNA在细胞中的分布”“DNA的粗提取与鉴定”等实验都选用了活细胞作为实验材料。同时，教材中也指出“DNA指纹法在案件侦破工作中有重要的用途。刑侦将从案发现场得到的血液、头发等样品中提取的DNA，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就有可能为案件的侦破提供证据”，并提出问题：“利用已灭绝的生物的DNA分子，真的能够使灭绝的生物复活吗？”对此，有些学生对在生物的生活环境中能否提取到DNA有疑惑，认为DNA是细胞内的分子，毛发主要成分是蛋白质，从毛发中能提取到DNA吗？恐龙早在白垩纪末期全部灭绝，能够在恐龙化石中提取到DNA吗？

2 环境DNA

环境DNA(environmental DNA，简称eDNA)的概念是在20世纪80年代末期提出的。eDNA是指从多样的环境样本(如土壤、沉积物、空气、水体等生物生活环境)中采集到的DNA，而不是直接从生物个体组织细胞获得的[1]。环境样本中通常含有动植物脱落的细胞或者是游离的DNA，包括生物排泄的尿液、粪便、黏液，脱落的皮肤，生物的遗迹遗体形成的化石等。这些环境样本不仅是“eDNA”的来源，还能提供一个环境系统中物种的存在状况。环境中DNA浓度对物种存在与否、物种的分布、物种的生物量、丰富度情况等可提供重要的参数[2]。例如，某种鱼在水体环境中活动时，会在环境中留下eDNA，若能在水体环境样本中提取到某种鱼的eDNA，则说明在某个时期该种鱼曾经来过或生活在这样的环境中。

3 从环境样本中提取到eDNA的可能性

从环境样本中之所以能提取到DNA，这与DNA结构稳定以及环境中的DNA酶失活有关。①DNA结构稳定。组成DNA的两条多核苷酸链反向平行盘绕形成双螺旋特定空间结构，DNA分子磷酸残基上的负电荷可与介质中的阳离子之间形成离子键，从而消除了两条链之间由于负电荷的相互作用而排斥的情况，使DNA分子空间结构保持稳定；DNA分子两条链通过碱基互补配对形成氢键，尽管单个氢键作用力非常微弱，但由于DNA分子是高分子聚合物，分子内部具有很多碱基对，在DNA分子内部形成大量氢键，从而维持了双螺旋空间结构稳定；组成DNA分子的碱基是疏水性的，在形成DNA分子时，由于疏水作用碱基在DNA分子中纵向层层堆积，形成碱基堆积力，这种碱基堆积力是DNA分子结构稳定的主要因素。②环境中的DNA酶容易失活。DNA酶如生物遗留在生活环境中的其他有机物那样，因环境的改变而使酶活性降低或失活，并很快被环境中的微生物降解。由于缺少了DNA酶的降解作用，从而使eDNA得以长时间稳定存在，为从环境样本中提取到eDNA提供了可能。例如，带有毛囊的毛发在很长时间内可以提取到DNA，在毛干中可以提取到线粒体DNA；古化石中的DNA与氧气隔绝，使得化石中DNA得以长期稳定存在。

4 环境样本的采集

4.1 环境DNA样本的采集 eDNA样本的采集通常源于水体、土壤和粪便等。从溪流、河水和海水中采集水样，一般样本量为1～2L[3]，水样的采集通常采用滤膜法或沉淀法。①滤膜法：通过该法过滤大量的水收集DNA，以增加可溶性DNA的收集量。应用直径为47mm、孔径为0.45μm的硝酸纤维素无菌过滤膜对水进行一次性过滤。然后将滤膜放置在无菌的2mL小瓶中，加入无水乙醇放置于-20℃保存备用。②沉淀法：通常用于物种监测为目的eDNA水样采集。首先，对预设好的环境生物样本采集样地用GPS定位，在不同的地点3次取样以提高水样中的物种覆盖度，增加物种检测概率，用塑料量筒量取15mL的水样，并加入1.5mL的3mol/L醋酸钠和33.5mL的无水乙醇于50mL的无菌离心管中，置于-20℃冰箱保存，以备实验室对eDNA进行提取和分析。醋酸钠有保护DNA的作用，使样品在室温下能保持稳定几个小时甚至几天。采取水样过程中始终佩戴一次性无菌手套，每采样一次及时更换手套。记录取样地点的生物环境特征，如采样的时间、天气、GPS定位的经纬度、生境的主要外貌以及水流状况等。季节、温度变化及地理位置对eDNA浓度具有一定程度的影响。

对于从土壤中采集DNA样本，由于研究区域的生物分布具有异质性，随机或有规律地采集来自不同深度的土样，每个取样地点应该至少收集两份样品，每份样品应将取样地点不同深度的土样混合。

4.2 环境DNA的提取对eDNA的提取方法有多种，如氯仿萃取法、细胞溶解的物理破碎法、二氧化硅提取法、试剂盒法[4]等。例如，利用QIAGEN DNA试剂盒可纯化长达50kb的DNA片段[5]。具体方法如下： ①从50mL的无菌离心管中转移200μL样品到试剂盒中(试剂盒含有优化的缓冲液，能有效裂解样本使DNA与蛋白质分离，稳定核酸并促进DNA选择性结合到QIAGEN硅胶膜上)；②将无水乙醇加入到裂解物中，并上样到QIAGEN离心柱上；在4℃下，8000～15000转/min离心；③用洗涤缓冲液去除杂质，再用低盐缓冲液洗脱出DNA，然后用70%的冰冻乙醇洗涤沉淀DNA 3次，干燥处理；④用100μL的TE(pH8.0)溶解DNA沉淀，得到eDNA提取液；⑤eDNA可通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分离后，再用于后续的研究。