盐胁迫对花生硝酸盐积累及信号转导的影响

孔伟伟 韩燕 刘译阳 李国卫 万书波 崔凤

摘要：为探索盐胁迫对花生硝酸盐积累的影响，本研究测定了盐处理花生叶片的硝酸盐含量，发现盐胁迫抑制硝酸盐的积累。进一步对花生地下部和地上部样品进行RNA-seq分析，发现13个花生中响应盐胁迫的硝酸盐吸收、转运以及信号转导的相关基因。本研究揭示了盐胁迫影响花生硝酸盐积累的可能机制，为进一步研究提供了目标基因。

关键词：花生；硝酸盐；盐胁迫；硝酸盐转运蛋白；差异表达基因；表达量

中图分类号：S565.201文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）06-0086-05

Abstract To understand the effects of salt stress on nitrate accumulation in peanut， we checked the nitrate contents in leaves under salt treatment， and found that salt stress inhibited the nitrate accumulation in peanut. Thirteen genes related to nitrate uptake， translocation and signal transduction in underground and aboveground samples were found response to salt stress by RNA-seq analysis. This study revealed the possible mechanism about how salt stress affecting nitrate accumulation in peanut and provided target genes for further research.

Keywords Peanut； Nitrate； Salt stress； Nitrate transporter； Differentially expressed genes； Expression level

植物在生长过程中会受到各种生物胁迫和非生物胁迫的影响，盐胁迫作为一种重要的非生物胁迫能够导致渗透胁迫和离子毒害，影响植物生理和代谢的很多方面，威胁植物的生长发育和产量[1]。氮是组成核酸、氨基酸、蛋白质等基本生物分子结构的必需组成元素，是植物生长发育的主要限制因子，也是影响作物产量的必需营养元素。大多数陆生植物将硝酸盐作为氮素的主要来源。盐胁迫影响土壤中的硝化作用和氨化作用，可能影响植物对氮素的吸收和代谢[2]。花生是世界五大油料作物之一，也是我国重要的油料作物和出口创汇产品。花生是需氮较多的作物，外源氮肥对其生长的促进主要表现在提供氮素营养，促进多种含氮化合物如蛋白质和核酸的形成，同时也促进叶绿素合成、相关酶及光合作用的增加[3]。而花生是一种中度盐敏感作物，产量受盐胁迫影响严重。目前，盐胁迫对花生硝酸盐的积累、吸收、转运和信号转导相关基因表达的研究还未见报导。本试验通过测定盐胁迫下花生叶片的硝酸盐积累量，并对盐处理前后的花生地下部和地上部进行RNA-seq检测，旨在探索花生在盐胁迫条件下对硝酸盐吸收、转运的分子机制并为遗传改良提供目标基因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用花生品种为鲁花14号，自供。

1.2 试验处理

将花生种子播在沙子中并置于光照培养箱中培养。培养条件为光照（200 μmol·m-2·s-1）16 h，相应温度为26℃；黑暗8 h，相应温度为24℃，湿度均保持在50%。待种子萌發8 d后将花生幼苗转移到水培钵（盛有2 L Hoagland营养液）中培养，每钵4株，每周更换营养液。

花生苗龄18 d时进行盐胁迫处理，设置Hoagland营养液中分别加入100、150、200、300 mmol·L-1 NaCl进行盐胁迫，以未添加NaCl的Hoagland营养液为对照。处理4 d后取倒3叶，充分干燥后进行硝酸盐测定。

依据硝酸盐测定结果，设置Hoagland营养液加入的盐胁迫浓度为250 mmol·L-1NaCl，同样以未添加NaCl的Hoagland营养液为对照。处理4 d后进行地上部和地下部取样用于表达谱分析，液氮速冻并保存在-80℃冰箱中备用。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 硝酸盐含量测定 采用比色法测定硝酸盐含量。取0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mmol·L-1标准浓度硝酸盐溶液10 μL，加入90 μL硝酸还原酶，室温反应30 min。加入60 μL N-1奈乙二胺盐酸和对氨基苯磺酰胺（N-1奈乙二胺盐酸∶对氨基苯磺酰胺=1∶1）反应2 h后，于540 nm波长处测定吸光值，制作标准曲线。对取样叶片干燥后称重，每份样品中加入适量的0.1 mmol·L-1 盐酸溶解硝酸盐，后用水稀释，取10 μL稀释液作为待测样品，于540 nm波长处测定吸光值。根据标准曲线计算每个样品的硝酸盐浓度，最后再根据稀释倍数和样品重量计算硝酸盐含量。

1.3.2 样品总RNA提取 250 mmol·L-1NaCl胁迫与对照样品分别在液氮中研磨。根总RNA用Trizol试剂提取，叶片总RNA用CTAB法提取。使用Agilent 2100（Agilent Technologies）生物分析仪对RNA进行质量和定量分析。

1.3.3 转录组和表达谱测序 分别取等量根和叶RNA进行转录组测序。建库以后通过华大Illumina HiSeq TM 2000测序平台进行测序。测序得到的raw reads过滤以后得到clean reads，clean reads被用来进行de novo组装，组装软件为Trinity。RNA-seq测序平台为Ion ProtonTM system （Life Technologies）。差异表达基因通过NOISeq方法进行筛选，筛选标准为log2ratio≥1 and probability ≥ 0.8。

1.4 數据处理

采用Microsoft Excel进行数据处理与做图。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对花生叶片硝酸盐含量的影响

盐胁迫处理下，花生叶片硝酸盐含量随盐浓度升高逐渐降低。在100、150、200、300 mmol·L-1NaCl处理浓度下，叶片内硝酸盐含量分别比对照降低33.42%、49.57%、74.64%、81.84%（图1）。表明盐胁迫对花生硝酸盐积累有抑制作用，且抑制作用随盐浓度升高而增强。

2.2 盐胁迫对花生硝酸盐吸收、转运以及信号转导相关基因表达的影响

为鉴定盐胁迫对花生硝酸盐吸收、转运以及信号转导相关基因表达的影响，从而明确造成花生硝酸盐积累量下降的分子机制，本试验进行了RNA-seq分析，并采用转录组数据作为参考基因组。部分硝酸盐转运相关蛋白的表达量在盐胁迫后发生了显著变化。nitrate transporter（NRT1.1）基因 CL6501.Contig1和NRT2.4基因CL4824.Contig1、CL4824.Contig2在地下部的表达量均大幅度下降，NRT3.1基因Unigene16840在地下部的表达量下降，而NRT1.2基因CL6344.Contig2的表达量在地下和地上部均上升。NRT1.5基因Unigene19802和Unigene19803在地下部和地上部均被盐胁迫大量诱导表达，尤其是在地上部，其表达被诱导至500倍左右。而另一个NRT1.5基因CL1925.Contig1在地下部表达量下降，地上部诱导不显著（表1，图2）。NRT1.4基因Unigene935只在地下部被盐胁迫显著诱导表达。NRT1.7基因Unigene24292在地下部和地上部均被诱导表达。SLAH3基因Unigene22279的表达在地上部显著上升。TGA4基因Unigene18749在地下部的表达量显著降低， TCP20基因CL10482.Contig1在地下和地上部的表达量均显著下降（表1）。

3 讨论与结论

硝酸盐是农田土壤中氮素的主要存在形式，也是陆生植物的主要氮素来源。盐胁迫严重影响植物的生长发育，使花生等作物减产。本试验发现盐胁迫导致花生硝酸盐积累减少，并且减少量随盐浓度的增加而增加；通过对盐处理前后的花生地下部和地上部进行RNA-seq分析可知，盐胁迫对花生硝酸盐积累的影响，可能是通过抑制硝酸盐吸收基因实现的。nitrate transporter（NRT） 1.1既是高亲和性又是低亲和性硝酸盐转运蛋白，其亲和性的转变依赖于101位的苏氨酸的磷酸化[4]。NRT1.1在植物地下部和地上部均有分布，除介导硝酸盐从外部的摄取和地上部的转运外，还能介导硝酸盐信号转导[5-7]。NRT1.2是低亲和性硝酸盐转运蛋白，NRT2.4是高亲和性硝酸盐转运蛋白，均介导硝酸盐的摄入[8，9]。NRT3.1与除NRT2.7以外的NRT2家族蛋白相互作用并促进其硝酸盐摄入活性[10，11]。S-type anion channel SLAH3在气孔保卫细胞中介导硝酸盐外排[12]。硝酸盐作为多种生理活动的关键信号因子，大约调控了10%的基因组表达，在这个过程中有一些调节因子参与了复杂的硝酸盐反应。TGA4和TCP20作为转录因子被报道在调节硝酸盐转运蛋白和同化作用基因方面起到重要作用[13]。

差异表达基因中，与硝酸盐吸收相关的NRT1.1基因CL6501.Contig1、NRT2.4基因CL4824.Contig1、CL4824.Contig2，NRT3.1基因Unigene16840在地下部的表达量均显著下降，只有NRT1.2基因CL6344.Contig2的表达量在地下和地上部均上升，而CL6344.Contig2在地下部的表达量相对于以上四个基因均较低，且诱导量不高，暗示硝酸盐吸收减少，可能是这些基因表达协同作用的结果，而CL6344.Contig2可能在盐胁迫条件下对花生进行硝酸盐摄取具有积极意义。硝酸盐从土壤中吸收到根部之后，先被同化成铵，后是氨基酸。由于同化作用所需的碳骨架来自光合作用，所以氨基酸的合成主要发生在地上部分。硝酸盐通过木质部导管被从根部迁移至地上部分。NRT1.5在这个过程中起重要作用[14]。本试验还发现花生NRT1.5基因Unigene19802和Unigene19803在对照条件下地下部和地上部表达量均较低，但都被盐胁迫大量诱导表达，尤其地上部的诱导倍数达到了500倍左右，暗示这两个花生NRT1.5基因在盐胁迫时对花生硝酸盐从地下部转运到地上部起到非常重要的作用，对是否能够提高植物耐盐性值得探讨；而另一个NRT1.5基因CL1925.Contig1在对照条件下表达量较高，盐处理后地下部表达量下降，地上部诱导不显著，暗示这个基因除硝酸盐转运功能，可能还具有硝酸盐摄取功能。据报道NRT1.4基因在叶柄中表达，与调节叶片硝酸盐平衡相关，NRT1.7被报道在将硝酸盐从老叶片动员到新生叶片的过程中起作用[15，16]，本试验中花生差异表达基因中的NRT1.4基因Unigene935只在地下部被盐胁迫显著诱导表达，暗示这个基因可能在盐胁迫时具有新功能；差异表达基因中的NRT1.7基因Unigene24292在地下部和地上部均被诱导表达，暗示这两个基因可能在盐胁迫时具有其他功能。目前大部分硝酸盐吸收、转运和调控蛋白在植物盐胁迫应答中发挥的功能及分子机制仍知之甚少，针对这些基因进一步的研究，有利于深入理解非生物胁迫条件下植物的应答机制，从而为达到提高作物氮肥利用效率和耐逆性的目标提供理论基础。

参 考 文 献：

[1] Munns R， Tester M. Mechanisms of salinity tolerance[J].Annu. Rev. Plant Biol.， 2008，59：651-681.

[2] Meng S， Su L， Li Y M， et al. Nitrate and ammonium contribute to the distinct nitrogen metabolism of Populus simonii during moderate salt stress[J]. PLoS ONE， 2016，11（3）： e0150354.

[3] 羅盛， 杨友才， 沈浦，等. 花生氮素吸收、根系形态及叶片生长对叶面喷施尿素的响应特征[J]. 山东农业科学， 2015，47（10）：45-48，59.

[4] Liu K H， TsayY F. Switching between the two action modes of the dual-affinity nitrate transporter CHL1 by phosphorylation[J].EMBO J.， 2003，22 （5）： 1005-1013.

[5] Remans T， Nacry P， Pervent M， et al. The Arabidopsis NRT1.1 transporter participates in the signaling pathway triggering root colonization of nitrate-rich patches[J].Proc. Natl. Acad. Sci.USA， 2006，103（50）：19206-19211.

[6] Noguero M， Lacombe B. Transporters involved in root nitrate uptake and sensing by Arabidopsis[J]. Front. Plant Sci.，2016 （7）：1391.

[7] Guo F Q， Wang R， Crawford N M. The Arabidopsis dual-affinity nitrate transporter gene AtNRT1.1 （CHL1） is regulated by auxin in both shoots and roots[J]. J. Exp. Bot.，2002，53 （370）：835-844.

[8] Huang N C， Liu K H， Lo H J， et al. Cloning and functional characterization of an arabidopsis nitrate transporter gene that encodes a constitutive component of low-affinity uptake[J]. Plant Cell， 1999，11（8）：1381-1392.

[9] Kiba T， Feria-Bourrellier A B， Lafouge F， et al. The Arabidopsis nitrate transporter NRT2.4 plays a double role in roots and shoots of nitrogen-starved plants [J]. Plant Cell， 2012，24 （1）：245-258.

[10]Li W B， WangY， Okamoto M， et al. Dissection of the AtNRT2.1：AtNRT2.2 inducible high-affinity nitrate transporter gene cluster[J]. Plant Physiol.， 2007，143（1）：425-433.

[11]Kotur Z， Mackenzie N， Ramesh S， et al. Nitrate transport capacity of the Arabidopsis thaliana NRT2 family members and their interactions with AtNAR2.1[J]. New Phytol.，2012，194（3）：724-731.

[12]Wang Y Y， Hsu P K，Tsay Y F. Uptake， allocation and signaling of nitrate[J]. Trends in Plant Science， 2012，17（8）：458-467.

[13]Kant S. Understanding nitrate uptake， signaling and remobilisation for improving plant nitrogen use efficiency[J]. Seminars in Cell & Developmental Biology， 2018，74：89-96.

[14]Lin S H， Kuo H F， Canivenc G， et al. Mutation of the Arabidopsis NRT1.5 nitrate transporter causes defective root-to-shoot nitrate transport[J]. Plant Cell，2008，20（9）：2514-2528.

[15]Chiu C C， Lin C S， Hsia A P， et al. Mutation of a nitrate transporter， AtNRT1：4， results in a reduced petiole nitrate content and altered leaf development[J]. Plant Cell Physiol.，2004，45（9）：1139-1148.

[16]Fan S C， Lin C S， Hsu P K， et al. The Arabidopsis nitrate transporter NRT1.7， expressed in phloem， is responsible for source-to-sink remobilization of nitrate[J]. Plant Cell， 2009，21（9）：2750-2761.