花生FAD基因家族的全基因组鉴定与表达模式分析

阮建 单雷 李新国 郭峰 孟静静 万书波 彭振英

摘要：脂肪酸去饱和酶（FAD）是合成不饱和脂肪酸的关键酶，在植物维持各项生命活动、应对生物与非生物胁迫方面具有重要作用。本研究对花生基因组中的FAD基因家族进行鉴定与生物信息学分析，并利用花生转录组数据对花生FAD（AhFAD）基因的表达模式及可变剪接形式进行分析。结果显示，在花生基因组中共有31个AhFAD基因，分为6类，AhSAD基因亚家族有12条序列，AhFAD2有6条序列，AhFAD3有4条序列，AhFAD4/5有3条序列，AhFAD6有2条序列，AhFAD7/8有4条序列。聚类分析表明，AhFAD有两大分支：游离AhSAD分支和膜结合AhFAD分支；膜结合AhFAD分支中AhFAD4/5起源最早，ω-3 AhFAD由ω-6 AhFAD进化而来；单双子叶聚类于不同分支。表达模式分析表明，AhSAD、AhFAD2和AhFAD3在种子中表达水平较高，AhFAD4/5、AhFAD6、AhFAD7/8在叶中表达量最高。可变剪接分析表明，AhFAD亚家族之间可变剪接形式差异明显，其中有12个AhFAD基因发生了可变剪接。TTS和TSS是发生最多的可变剪接事件，其次是IR，最少的是AE和ES。

关键词：花生；脂肪酸去饱和酶（FAD）；生物信息学分析；表达模式；可变剪接

中图分类号：S565.2：Q7文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）06-0001-09

Abstract Fatty acid desaturase （FAD） is a key enzyme in the synthesis of unsaturated fatty acids， which plays an important role in maintenance of various life activities of plants and in response to biotic and abiotic stresses. In this study， the peanut FAD （AhFAD） gene family were identified and conducted bioinformatics analysis in genome-wide range， and the expression pattern and alternative splicing forms of AhFADs were analyzed using peanut transcriptome data. The results showed that there were 31 AhFAD genes in peanut genome， which could be divided into 6 subfamilies. There were 12 members in AhSAD subfamily， 6 members in AhFAD2 subfamily， 4 members in AhFAD3 subfamily， 3 members in AhFAD4/5 subfamily， 2 members in AhFAD6 subfamily and 4 members in AhFAD7/8 subfamily. Clustering analysis showed that there were two major branches of AhFAD： free and membrane-binding AhFAD branch. In membrane-binding AhFAD branch， the origin of AhFAD4/5 was the earliest， the ω-3 AhFAD was evolved from ω-6 AhFAD， and the mono-dicotyledonous AhFAD was clustered in different branches. The expression levels of AhSAD， AhFAD2 and AhFAD3 in seeds were higher， while AhFAD4/5， AhFAD6 and AhFAD7/8 had the highest expression in leaves. The analysis of alternative splicing showed that there were significant differences in alternative splicing forms among the subfamilies of AhFAD， of which， 12 AhFAD genes had alternative splicing isoforms. TTS and TSS were the most frequent alternative splicing events， followed by IR， and the fewest ones were AE and ES.

Keywords Peanut； Fatty acid desaturase （FAD）； Bioinformatics analysis； Expression pattern； Alternative splicing

脂肪酸（fatty acid，FA）是由碳、氫、氧三种元素组成的一端含有一个羧基的长脂肪族碳氢链，是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分，在维持机体代谢、参与细胞信号识别和组织免疫应答、应对各种环境胁迫等方面具有重要作用[1]。根据碳氢链的饱和程度不同，FA分为饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）和不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）两类。根据UFA双键个数的不同，分为单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA，含有一个双键，主要有棕榈油酸和油酸）和多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA，含两个或两个以上双键）[2]。PUFA是动物和人类的必需脂肪酸，自身不能合成，必须通过摄取外源不饱和脂肪酸来维持机体正常运行[3]。

脂肪酸去饱和酶（FAD）是形成UFA的关键酶，它可以在SFA的基础上引入单个或多个不饱和键。植物体内FAD可以分为两大类：游离的硬脂酰-ACP去饱和酶（△9-SAD）和膜结合脂酰-脂去饱和酶FAD[4-6]。根据位置不同可将膜结合FAD分为质体FAD（FAD4、FAD5、FAD6、FAD7、FAD8）和内质网FAD（FAD2和FAD3）。SAD作用于硬脂酰-ACP，FAD4和FAD5作用于脂酰-脂中C16∶0脂肪酸[7]；ω-6 FAD（FAD2和FAD6）和ω-3 FAD（FAD3、FAD7、FAD8）在脂酰-脂中分别引入第二个和第三个双键，其中ω-6 FAD以C18∶1为底物[8， 9]；ω-3 FAD以C16∶2或C18∶2为底物[10]。

△9-SAD属于脂酰-ACP去饱和酶家族，底物是硬脂酰-ACP，在质体内通过氧化还原过程在C9位和C10位之间引入第一个双键，将C18∶0催化为C18∶1从而增加C18∶1含量[7]；ω-6 FAD将C18∶1△9转化为C18∶2△9，12，ω-3 FAD催化C18∶2△9，12形成C18∶3△9，12，15；FAD4和FAD5在脂酰-脂中将C16∶0氧化为C16∶1△7；在糖脂中FAD6还能将C16∶1△7氧化为C16∶2，FAD7和FAD8能促进C16∶2向C16∶3脂肪酸转化[11]。

基因通过转录和翻译过程发挥功能，mRNA前体可通过不同的剪接形式产生多种mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接（alternative splicing，AS）[12]。可变剪接是基因转录后编辑的重要形式，是基因表达调节和蛋白质多样性的重要机制，是导致基因和蛋白质数量差异的重要因素之一。可变剪接有5种基本形式：内含子保留（intron retention，IR）、外显子跳跃（exon skipping，ES）、外显子5′或3′端可变剪接（alternative 5′or 3′ exon ends，5′-AE or 3′-AE）、轉录起始位置可变剪接（alternative transcription start site，TSS）和转录终止位置可变剪接（alternative transcription terminal site，TTS）。动物和酵母中，ES是主要的可变剪接形式[13]，而在植物中IR占主要地位[14]。据报道，在鼠、猪、狗、狐狸、鸡和马等动物中，FAD具有多种可变剪接异构体，其表达模式各不相同[3，15]，但是对于它们在油脂合成中的功能却没有进行深入研究。

花生是我国重要的油料作物之一，籽粒含油量一般在50%左右，95%的油脂以三酰甘油（triacylgycerol，TAG）的形式贮存，其中C18∶1和C18∶2占整个油脂组分的80%，油亚比大约在1左右[16-18]。目前针对花生育种开展较多的工作是高产和高油酸育种，部分AhFAD基因已被克隆并进行了功能验证，但是关于该家族的系统分析却很少[19，20]。本研究利用花生基因组数据库[21]，对AhFAD基因家族的进化关系、基因结构、保守结构域、亚细胞定位及表达模式、可变剪接等进行分析，为利用分子技术改良花生品种提供一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 AhFAD基因检索

根据NCBI公布的花生及其他豆科植物FAD基因序列，在花生基因组数据库Peanutbase（https：//www.peanutbase.org/）进行检索。将检索得到的全部基因序列及其基因组序列下载，以FASTA格式进行保存，并将cDNA翻译成氨基酸序列进行分析。

1.2 AhFAD的生物信息学分析

根据AhFAD氨基酸序列信息，在NCBI数据库中进行同源检索，检索条件设置为Ident>75%，检索物种为：麻风树（Jatropha curcas，Jcu）、鹰嘴豆（Cicer arietinum，Car）、大豆（Glycine max，Gma）、蓖麻（Ricinus communis，Rco）、可可（Theobroma cacao，Tca）、木豆（Cajanus cajan，Cca）、白毛杨（Populus tomentosa，Pto）、哥伦比亚锦葵（Herrania umbratica，Hum）、南瓜（Cucurbita moschata，Cmo）、绿豆（Vigna radiata，Vra）、狭叶羽扇豆（Lupinus angustifolius，Lan）、棉豆（Phaseo luslunatus，Plu）、野大豆（Glycine soja，Gso）、赤豆（Vigna angularis，Van）、川桑（Morus notabilis，Mno）、枣（Ziziphus jujuba，Zju）、巴旦木（Prunus persica，Ppe）、棉花（Gossypium raimondii，Gra）、毛果杨（Populus trichocarpa，Ptr）、核桃（Juglans regia，Jre）、巴西橡胶树（Hevea brasiliensis，Hbr）、玉米（Zea mays，Zma）、乌拉尔图小麦（Triticum urartu，Tur）、粳稻（Oryza sativa，Os）、粟米（Setaria italica，Sit）、高粱（Sorghum bicolor，Sbi）、短花药野生稻（O. brachyantha，Obr）、凤梨（Ananas comosus，Aco）、节节麦（Aegilops tauschi，Ata）。去除同物种重复基因序列后将AhFAD序列与其他物种FAD进行比对分析，利用Mega6软件使用邻近法构建进化树，置信度通过1 000次自展重复计算。利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线软件分析AhFAD跨膜结构域；利用TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）在线软件分析AhFAD亚细胞定位；利用MEME（http：//meme-suite.org/）在线软件分析AhFAD保守结构域。

1.3 AhFAD的表达量和可变剪接分析

根据花生转录组数据（NCBI： PRJNA354652）中AhFAD的FPKM值，用HemI软件进行表达模式分析。用ASTALAVISTA program （http：//genome.crg.es/astalavista/）分析其可变剪接情况。

2 结果与分析

2.1 AhFAD基因家族的生物信息学分析

在花生基因组数据库中进行基因序列检索，共获得31条AhFAD序列，其中AhSAD有12条序列，AhFAD2有6条序列，AhFAD3有4条序列，3条AhFAD4/5序列，2条AhFAD6序列，4条AhFAD7/8序列（表1）。4条序列（Aradu.7W39T、Araip.31Q5V、Araip.CD8XS、Aradu.C4479）的CDS不是从ATG起始密码子开始，N端序列缺失；2条序列（Araip.GX1CD和Aradu.L1M1M）没有预测到终止密码子，C端序列缺失；2条序列（Araip.65EGG和Aradu.UT0N9）相较于其他序列很短。

2.2 31个AhFAD的基因组分布

从表1可以看出，这31个基因位于15条染色体的不同位置，其中A基因组中有15个，不均匀地分布于8条染色体上，Aradu.02、Aradu.08和Aradu.09上各有3个，Aradu.01上有2个，Aradu.04、 Aradu.06、 Aradu.07和Aradu.10上各有1个，而Aradu.03和Aradu.05则没有。B基因组中有16个，不均匀地分布于7条染色体上，Araip.07和Araip.09上最多，各有4个；Araip.01、Araip.02和Araip.06上各有2个，Araip.04和Araip.10上各有1个，而Araip.03、 Araip.05和Araip.08上则没有。

2.3 AhFAD跨膜区与亚细胞定位分析

用软件对31个AhFAD蛋白进行跨膜区和亚细胞定位预测（表1），发现不同亚家族的跨膜区和亚细胞定位均有不同。AhSAD的跨膜区数目最少，为0～1个；AhFAD2跨膜区最多，为5～6个；AhFAD3～AhFAD8跨膜区有3～4个。亚细胞定位预测表明，AhFAD2和AhFAD3定位于内质网上，而其它亚家族蛋白定位于叶绿体上。

2.4 基因结构分析

AhFAD亚家族基因结构分析显示，它们具有明显不同的特点（表1，图1）。AhSAD和AhFAD2外显子数目最少，为1～4个；ω-3 FAD家族（AhFAD3、AhFAD7/8）外显子数为7～9个；AhFAD4/5家族的外显子数目均为5个；AhFAD6家族的外显子数目差异较大，Araip.AML9J有10个，Aradu.UT0N9只有6个，分析由测序结果不完全造成。通过对比发现，AhFAD6和ω-3 AhFAD家族（FAD3、FAD7/8）外显子数目较多，结构复杂，AhFAD4/5次之，AhSAD和AhFAD2结构最为简单。

2.5 系统进化分析

将23条完整AhFAD的氨基酸序列与其他物種65条序列构建进化树（图2）。发现无论是单子叶植物还是双子叶植物，FAD均根据蛋白是否与膜结合分为两大分支：游离SAD单独分为一支，其他膜结合FAD位于另一大分支。

SAD分支中，单子叶植物和双子叶植物分别位于两个不同的分支。膜结合FAD分支基本分为3大类：位于最上游分支的FAD4/5家族，中间ω-6 FAD家族系列，以及分支末端的ω-3 FAD家族。ω-6 FAD家族中质体FAD6亚家族和内质网FAD2亚家族分别聚类于不同分支，ω-3 FAD家族中FAD3与FAD7/8亦是如此。由此推断，植物膜结合FAD起源于SAD，膜结合FAD亚家族中FAD4/5起源最早，ω-3 FAD家族由ω-6 FAD进化而来，根据定位不同两个ωFAD家族又可分为质体和内质网两小类。从单子叶、双子叶方面来看，每个FAD亚家族又聚类为单子叶植物和双子叶植物两个分支。花生与其他植物进化分支一致，与豆科植物亲缘关系较近。

2.6 表达模式分析

根据花生转录组数据（NCBI：PRJNA354652）对AhFAD基因的表达模式进行分析，发现各个亚家族之间的表达模式存在很大差异（图3）。

在AhSAD家族中，Aradu.L1M1M和Araip.6S389在4个组织中均有表达，但是在Seed2中表达量最高，由此可见这两个基因在花生生长发育和种子脂肪酸积累中具有关键作用。6个AhFAD2基因中，Araip.S3GXY在Seed2中表达量最高，表明该基因是催化花生种子中亚油酸合成的主要基因；Araip.D6HPL在叶中表达量最高，说明该基因主要参与叶中亚油酸合成。4个AhFAD3基因中，Aradu.5N10F相对于其它3个基因表达量最高，特别是在Seed2阶段。AhFAD4/5和AhFAD6基因家族表达模式类似，在叶中的表达量较高，表明它们对叶片中UFA合成具有重要作用。4个AhFAD7/8基因中，Aradu.AV1HQ和Araip.92Q2X主要在叶中表达，说明二者主要在叶片的UFA合成中具有重要作用。

在Seed2和叶中表达的AhFAD基因数目较多，表达量较高，说明这2个组织是UFA需求较多的部位。并且在Seed2阶段，2个AhSAD和1个AhFAD2的超高表达应该是花生种子中C18∶1和C18∶2占油脂总量80%的原因。

2.7 保守结构域分析

分析FAD家族的保守结构域（图4）发现，AhSAD的Motif 1保守结构域中含有第一个Fe原子配基E12和H49，Motif 2保守结构域含有另一个Fe原子配基E7和H48，两个Fe原子通过Motif 1和Motif 2中两个连桥配基（E46和E45）连接形成 Fe-O-Fe二铁氧簇（diiron-oxo cluster）结构（图4A）；SAD 保守区4个重要的α螺旋束α3（α3a 和 α3b）、α4、α6和α7及其侧链将二铁氧簇结构深埋其中构成酶活性中心。

AhFAD2、AhFAD3和AhFAD7/8序列相对保守，Motif 1和 Motif 2中分别含有花生Histidine box 3两端特有保守侧翼结构序列FXXXPHYHXXEA和EWXXLRGXLXT，Motif 4和Motif 5分别包含了Histidine box 1（XHXCGHX）和Histidine box 2（WXXSHRXHH）两个组氨酸富集区。FAD4/5和FAD6与其他膜结合FAD亚家族差异明显，其中FAD6家族只含有Histidine box 1和Histidine box 2两个组氨酸富集区；而FAD4/5差异最大（图4B），缺失组氨酸富集区。

2.8 可变剪接分析

利用转录组数据分析AhFAD基因的可变剪接事件，发现共有12个AhFAD基因发生可变剪接事件，其可变剪接形式差异明显（表2）。共发生5种类型的可变剪接：转录起始位置可变剪接（TSS）、转录终止位置可变剪接（TTS）、外显子跳跃（ES）、内含子滞留（IR）和可变外显子 5′或3′端剪接（AE）。其中发生最多的是TSS和TTS，分别为20次和18次；其次是IR，发生12次；AE和ES分别发生5次。

AhSAD亚家族有两个基因仅发生了TSS和TTS；AhFAD2亚家族中2个基因都发生了TSS和TTS，其中Aradu.G1YNF在Seed1中还发生ES；AhFAD3家族3个基因发生了可變剪接，Aradu.5N10F只在Seed1中发生TTS，Araip.84LR8在根中发生TTS、TSS和IR，Araip.CGW17则在Seed1和Leaf两个组织中分别发生ES和TSS；FAD4/5基因家族有一个基因Aradu.42SWI在Leaf中发生ES、TSS和TTS；FAD6和FAD7/8基因家族都存在四种可变剪接形式，分别为TSS、TTS、IR和AE。

3 讨论与结论

FAD基因在UFA合成中起关键作用，其功能一直是研究热点。水稻、芝麻、油桐等植物中相关基因已被克隆并进行了功能验证[1，9，22]花生中部分FAD基因已经被克隆并在微生物或模式植物烟草中进行了功能验证，但对花生基因组中所有FAD基因家族的系统分析却较少。

曾有报道将部分植物和微生物FAD氨基酸序列进行进化分析，发现SAD起源最早，原核生物ω-3 FAD由ω-6 FAD进化而来，植物ω-3 FAD功能的分化早于单双子叶植物分化，而FAD2功能分化出现于双子叶植物形成之后[23]。通过将AhFAD序列及其他20多种单子叶植物和双子叶植物物种FAD序列构建进化树发现植物ω-3 FAD位于ω-6 FAD分支下游，预示着植物ω-3 FAD由ω-6 FAD进化而来，FAD4/5起源早于ω FAD。且同一基因家族单双子叶聚类于不同分支说明FAD可分为单子叶和双子叶植物 2 个亚类。但研究FAD具体进化机制需要将真核和原核生物结合，把所有动植物和微生物中已发现的FAD基因结合进行进化研究。

单外显子基因是原核生物的一个重要特征，从真核酵母开始出现断裂基因，其外显子数目少且序列短，单内含子偏向基因的5′端；高等真核生物基因外显子增多，尤其是哺乳动物多达十几个[24]。有研究表明随着真核生物的基因组增大，其内外显子数目和重复序列都会增加，但并不是生物越高等， 基因中的外显子数就越大[25]。基于这一观点分析AhFAD结构，AhFAD6和ω-3 AhFAD外显子数目最多，结构最为复杂，AhFAD4/5家族次之，AhSAD和AhFAD2外显子数目最少，结构最简单。此结论无法推断AhFAD外显子数目与进化关系，这有待于将外显子、内含子、重复序列、保守域等相结合开发更精确的分析软件和新算法来研究。

与棉花、玉米、橄榄等其他高等植物SAD保守序列相同[26-28]，所有AhSAD均具有酶活性中心的4个α-螺旋保守结构域，说明其能构成△9-SAD脱氢酶活性中心，能结合底物促进油酸合成。不同亚家族保守域差异明显，同为ω-6家族的AhFAD6家族与AhFAD2保守域差异大，说明两者在进化过程中分歧较大。ω-3 AhFAD亚家族高度保守，均含有3个组氨酸富集区[29]，AhFAD4/5亚家族则缺失组氨酸富集区。酶与底物的紧密结合和功能的发挥与酶活性中心密切相关，基因保守结构域是酶活性的重要保障，花生FAD基因保守结构域差异反映出酶具有不同的进化功能。

表达模式分析表明AhFAD家族表达模式存在明显差异，AhSAD、AhFAD2和AhFAD3在种子中的表达水平大于根和叶，尤其是种子后期，这说明3个家族主要参与种子后期不饱和脂肪酸积累。AhFAD4/5、AhFAD6、AhFAD7/8在叶中表达量最高，说明3个家族主要作用于叶中不饱和脂肪酸合成，结果与水稻和大豆的表达模式一致[30，31]。有文章报道水稻FAD2基因在叶中表达量最高[32]，这可能与物种及基因的组织特异性表达以及取材时期不同有关。

小鼠中ES造成Fads3缺失37个aa，可变剪接体Fads3 AT9在组织中的高表达对长链PUFA的合成具有重要作用[15]。狒狒中多外显子跳跃产生新转录本FADS2 AT1，该基因的组织差异表达模式调节长链PUFA合成[33]；FADS3有7种剪接异构体，其中FADS3 AT1的高表达与4个FADS3 AT的协同表达共同参与PUFA的形成[34]。花生FAD基因家族TTS和TSS是发生最多的可变剪接事件，其次是IR，最少的是AE和ES，这与动物FADS有很大差异，分析可能是物种特异性差异造成的。但AS可以产生蛋白质异构体和信号分子的模板，在AhFAD基因功能发挥中具有重要作用。

参 考 文 献：

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