花生FAT基因家族的全基因组分析

张会 单雷 李新国 郭峰 孟静静 万书波 彭振英

摘要：酰基-ACP硫酯酶（fatty acyl-ACP thioesterase，FAT）是控制植物种子油脂合成的关键酶，根据其氨基酸序列和底物特异性不同可分为FATA和FATB两类。为了更深入了解花生FAT（AhFAT）的特点与功能，本研究对AhFAT家族基因进行了全基因组生物信息学分析。在花生基因组中共有20个FAT基因，不均匀分布在2个基因组的12条染色体上。20个AhFATs可以分为AhFATA和AhFATB两个亚家族，AhFATA亚家族有2个基因，AhFATB亚家族有18个基因。AhFATA家族基因具有6或8个外显子，AhFATB家族基因结构较为复杂，外显子数目5～8个；AhFATs都不具有跨膜结构域但是都具有保守的Acyl-ACP_TE结构域。对AhFAT家族基因进行可变剪接分析，发现只有少数发生了可变剪接，且具有组织特异性。对AhFATs表达模式分析的结果显示，AhFATAs和AhFATBs都在种子发育后期表达量较高。

关键词：花生；酰基载体蛋白硫酯酶（FAT）；可变剪接；表达模式

中图分类号：S565.2：Q7文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）06-0019-08

Abstract Fatty acyl-ACP thioesterase （FAT） is the key enzyme regulating the synthesis of plant seed oil. According to the amino acid sequence and substrate specificity， FAT is divided into FATA and FATB subfamily. In order to better understand the characteristics of AhFAT gene family， the bioinformatics analysis was carried out. There were 20 AhFAT genes in the peanut genome， which heterogeneously distributed on 12 chromosomes in the two genomes. The twenty AhFAT genes could be divided into AhFATA and AhFATB subfamily， which had 2 and 18 members respectively. The AhFATA subfamily owned 6 or 8 exons， and the AhFATB subfamily had complex gene structures with 5～8 exons. None of the AhFATs had transmembrane domains， but they all owned the conserved Acyl-ACP_TE domain. The alternative splicing analysis of AhFAT gene family revealed that only a few AhFATs undergone alternative splicing and they had different splicing types in different tissues. The AhFATs expression pattern analysis results showed that both AhFATAs and AhFATBs expressed at higher levels in the later stage of seed development.

Keywords Peanut； Fatty acyl-ACP thioesterase （FAT）； Alternative splicing； Expression pattern

在高等植物中，脂肪酸生物合成是由位于质体中的Ⅱ型脂肪酸合成酶催化完成的[1]。该反应包括丙二酸单酰辅酶A与酰基-ACP衍生物的聚合反应，使酰基碳链以每个循环增加两个碳单位进行延伸[2]。酰基-ACP硫酯酶（fatty acyl-ACP thioesterase， FAT）终止脂肪酸合成，水解酰基和ACP之间的硫酯键，释放出游离脂肪酸和ACP[3-6]。脂肪酸被运送到细胞质中进一步酯化形成脂酰-CoA，然后在内质网上进行脂肪酸链的延长和脱饱和、磷脂和甘油三酯的合成等代谢[7，8]。FAT的特异性在很大程度上决定了大多数植物脂肪酸链的长度和不饱和度[9]。

FAT是由核基因编码的质体靶向的可溶性酶[7]。根据其氨基酸序列和底物偏好性分为FATA和FATB两个亚家族[10，11]。FATA偏好不饱和酰基-ACP，尤其对18∶1-ACP活性最高[12，13]。相反，FATB通常对饱和酰基-ACP显示出高活性，但是它对18∶1-ACP也有一定的活性[4，14]。目前，FAT基因已在拟南芥[15]、向日葵[12]、麻风树[16]、紫苏[17]、椰子[18]、蓖麻[19]、毛白杨[14]等植物中相继被克隆。

FAT的底物特异性对确定植物油的脂肪酸组成和含量具有重要意义[4，20-22]。如将拟南芥AtFATA在大肠杆菌中过表达，脂肪酸组成没有发生变化，但是重組菌株脂肪酸产量相比对照菌株提高了70%，同时胞外游离脂肪酸产量是野生菌株的7倍并占总脂肪酸含量的15%[23]。向日葵FATA1基因在大肠杆菌中表达导致细菌总脂肪酸含量增加，这种增加在游离脂肪酸中最显著，而对照菌株中游离脂肪酸基本不存在[12]。Bonaventure等发现AtFATB基因发生断裂后导致不同组织中饱和脂肪酸的总量相比于野生型拟南芥减少了40%至50%，其中棕榈酸含量明显降低[15]。这种减少只发生在饱和脂肪酸的胞质池中，影响胞外磷脂的脂肪酸组成、茎和叶中蜡质以及种子中三酰甘油的合成[24]。AtFATB基因的突变降低了突变体的生长速率，导致幼苗在第4周时高度大约是野生型的一半。相反，在拟南芥过量表达AtFATB1则导致棕榈酸积累，表明AtFATB1对拟南芥棕榈酸的产量有一定影响[25]。随后又在麻风树中克隆得到了FATB1基因，将JcFATB1基因在拟南芥中过表达可导致饱和脂肪酸含量增加，特别是棕榈酸含量增加，而不饱和脂肪酸水平降低[16]。

花生（Arachis hypogaea L.）起源于南美洲，是我国重要的油料作物之一，在全球许多地区都有种植[26，27]。花生油主要由棕榈酸（10%）、油酸（36%～67%）和亚油酸（15%～43%）组成[3]。由于FAT对于控制植物油中脂肪酸含量和组成具有重要作用，所以利用FAT降低花生种子中棕榈酸的相对含量，改良油品质具有重要意义。目前，关于AhFAT的研究多集中在异源表达和底物特异性研究方面。陈高从花生发育种子中克隆了AhFATA基因，该基因在花生所有组织中均有表达，而且在大肠杆菌中表达该基因可以改变其脂肪酸组成，导致棕榈油酸和油酸积累[24]。后来陈高又从花生种子中克隆了AhFATB1基因，该基因在花生所有组织中均有表达，但是在未成熟种子表达量最高；当其在大肠杆菌中诱导表达时，转基因菌株中肉豆蔻酸、棕榈油酸和油酸含量显著上升[24]。廖伯寿课题组分别从野生花生A. duranensis和A. ipaensis克隆了AhFATB1A和 AhFATB1B基因，分别属于A-基因组和B-基因组[3]。但是到目前为止，有关AhFAT基因家族的全基因组研究报道较少。本研究针对AhFAT家族基因进行了系统分析，为研究AhFATs的特性及其对花生种子脂肪酸合成的影响提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 AhFAT基因获取

利用NCBI公布的花生AhFATA基因序列（GU324446.1）和AhFATB基因序列（EF117305.1）作为参考序列在花生基因组数据库Peanutbase（https：//www.peanutbase.org/）进行比对，得到AhFAT基因并对其进行生物信息学分析。

1.2 AhFAT基因生物信息学分析

利用DNAMAN软件将获取的AhFAT氨基酸序列与NCBI中苜蓿（Medicago truncatula，Mt）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，At）、大豆（Glycine max，Gm）的FATA（ACB29661.1、NP_189147.1、XP_006602508.1）和FATB（ADA79524.1、NP_172327.1 、XP_003522440.1）氨基酸序列进行比对，分析序列之间的相似区域和保守性位点。为进一步探究AhFAT的进化关系，我们利用AhFATA（GU324446.1）和AhFATB（EF117305.1）氨基酸序列在植物基因组数据库Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中进行Blast搜索。从藻类：杜氏盐藻（Dunaliella salina，Dsa）、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii，Cre）；苔藓类：小立碗藓（Physcomitrella patens，Ppa）、地钱（Marchantia polymorpha，Mpo）；蕨类：卷柏（Selaginella moellendorffii，Smo）；单子叶植物：玉米（Zea mays，Zma）、水稻（Oryza sativa，Osa）、高粱（Sorghum bicolor，Sbi）；双子叶植物：拟南芥（Arabidopsis thaliana，Ath）、大豆（Glycine max，Gma）、油菜（Brassica rapa，Bra）、棉花（Gossypium raimondi，Gra）、蓖麻（Ricinus communis，Rco）、黄瓜（Cucumis sativus，Csa）、毛果杨（Populus trichocarpa，Ptr）、苜蓿（Medicago truncatula，Mtr）、可可（Theobroma cacao，Tca）等17个物种中检索出同源序列。将检索得到的序列与AhFAT序列利用软件MEGA 5.0进行比对，采用临接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树，Bootstrap重复次数设置为1 000。利用TMHMM（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和ProtComp 9.0（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcomppl&group;=programs&subgroup;=proloc）分析跨膜結构域和亚细胞定位。利用在线SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）进行保守结构域分析。利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析基因结构。

1.3 AhFAT基因的可变剪接和表达模式分析

本实验室前期对栽培花生‘丰花一号的根、叶、果针入土30 d（Seed1）和50 d（Seed2）进行了转录组测序，已将数据上传至NCBI（NCBI： PRJNA354652）。本试验根据该转录组数据中AhFAT的FPKM值，用HemI软件进行表达模式分析。用ASTALAVISTA program （http：//genome.crg.es/astalavista/）分析其可变剪接情况。

2 结果与分析

2.1 AhFAT家族基因获取

以NCBI中AhFATA（GU324446.1）和AhFATB（EF117305.1）作为参考序列在花生基因组数据库Peanutbase进行搜索，找出了20个AhFAT基因（表1）。分析结果发现20个AhFAT基因不均匀地分布于2个基因组中的12条染色体上，其中有9个位于A基因组，11个位于B基因组。Araip.B03上分布有4个AhFATs，Aradu.A01和Araip.B02各有3个，Aradu.A02上有2个，其余8个染色体上各有1个。AhFAT分为AhFATA和AhFATB两个亚家族，AhFATA亚家族有2个基因Aradu.J7RE1和Araip.D1M07，它们是一对等位基因，分别位于Aradu.A04和Araip.B04上。AhFATB亚家族有18个基因，其中包含7对等位基因，分别位于7对染色体上。由于Araip.T3UA2基因不完整，可能会使结果产生很大的误差，所以不予分析。

2.2 多序列比对及进化分析

将AhFATs与其它物种FAT进行比对（图1），发现FATA和FATB在N端差异极大，由此推测N端的差异可能是造成两个亚家族底物特异性不同的原因。而且FATB的序列基本都比FATA的序列要長。所选其它物种两个亚家族蛋白的氨基酸序列中都保留了三个类似木瓜蛋白酶类三联体的保守残基，而AhFAT个别序列中天冬酰胺N和组氨酸H与已知物种FATB和FATA序列中的保守残基不同。FATA和FATB在第150至370氨基酸之间的核心区域保守性较高，表明两亚家族之间存在着相似的高级结构和功能[7]。

利用MEGA5.0对19个AhFATs与其它17个物种的FAT蛋白序列进行比对，并构建系统进化树（图2）。结果显示，FAT家族分成两个大的分支，即FATA和FATB两个亚家族，两分支都具有高度的保守性；藻类植物单独为一个分支，说明各植物FAT与藻类的亲缘关系较远。

在FATA亚家族分支中，苔藓和蕨类植物单独分为一支，单子叶和双子叶植物也各自分为一支，花生Araip.D1M07和Aradu.J7RE1与苜蓿在同一分支上，表明两者亲缘关系较近。FATB亚家族基因数目比较大，分支也比较复杂，苔藓和蕨类植物在同一分支上，单子叶植物和双子植物还分为多个小的分支，这可能是由FATB亚家族的不同进化过程造成。AhFATB家族与大豆、苜蓿的亲缘关系较近，而与棉花、毛果杨、油菜、蓖麻的亲缘关系较远。

2.3 跨膜结构域、保守结构域和亚细胞定位分析

利用TMHMM分析19个AhFATs的跨膜结构域，结果发现它们都不含有跨膜结构，属于胞质可溶性蛋白。但是该家族的基因都含有保守的Acyl-ACP_TE结构域，是典型的植物硫酯酶家族成员。其中Aradu.8Y7VD、Araip.J6FGQ、Aradu.Q57RH、Aradu.J7RE1和Araip.D1M07都具有两个Acyl-ACP_TE结构域。利用ProtComp 9.0预测AhFATs的亚细胞定位（表1），结果表明除了Araip.MR3NT的定位不够明确外，其余AhFATs都定位在叶绿体中。

2.4 基因结构分析

通过对AhFATs的基因结构进行分析发现，AhFATA和AhFATB的基因结构有不同特点。AhFATA家族有2个成员，分别具有6个和8个外显子。AhFATB家族基因结构比较复杂，它们的外显子数目差别较大，从5个到8个不等（图3）。等位基因的基因结构类似，如Aradu.J7RE1和Araip.D1M07，Aradu.ZG6C0和Araip.SBA9Y。有些基因的预测序列不完整，如Aradu.Q1LBD，其基因结构与Araip.1PE3B的3′端类似，而缺少5′端部分序列。

2.5 可变剪接事件预测

根据转录组数据对AhFAT的可变剪接事件进行预测，结果表明，在19个AhFATs中，有5个具有可变剪接现象，仅占26%（表2）。发生可变剪接的类型也较少，只有转录起始位点可变剪接（TSS）、转录终止位点可变剪接（TTS）和外显子末端可变剪接（AE）。TSS发生频率最高，有12次；其次是TTS，有6次；AE仅发生3次。不同AhFAT的可变剪接具有明显的差异。AhFATA亚家族的两个基因在四个组织中都发生了可变剪接。Aradu.J7RE1和Araip.D1M07都发生了TSS和TTS，其中基因Aradu.J7RE1还发生了AE。AhFATB家族基因虽然多，但是大多都没有发生可变剪接，只有Araip.SBA9Y、Aradu.ZG6C0和Aradu.8Y7VD发生了可变剪接，仅占16.7%；其中Araip.SBA9Y和Aradu.ZG6C0均发生了TSS，Aradu.8Y7VD发生了AE和TTS。

2.6 表达模式分析

利用转录组数据中各基因的FPKM值对AhFATs的表达模式进行分析（图4）。结果表明，在20个AhFATs中，Aradu.ZL5SD、Araip.RRH7G、Araip.4509F、Araip.3B5IK在四个组织中都不表达，Aradu.Q1LBD、Araip.T3UA2、Aradu.0EA4R、Araip.S1TFK、Aradu.B3QR0、Aradu.D1B7C、Araip.J6FGQ、Araip.MR3NT、Aradu.Q57RH、Araip.1PE3B只在一个或者两个组织中表达，只有6个基因在四个组织中都表达。AhFATB亚家族基因的表达量总体而言高于AhFATA亚家族。AhFATA家族的两个基因Aradu.J7RE1和Araip.D1M07在四个组织中均有表达，且在种子发育后期表达量较高。AhFATB亚家族中Araip.21S3V、Aradu.8Y7VD、Aradu.ZG6C0和Araip.SBA9Y在四个组织中也均有表达，Araip.21S3V和Aradu.8Y7VD在种子发育后期表达量最高，表明二者在花生种子油脂合成中具有主导作用；Aradu.ZG6C0和Araip.SBA9Y在叶中表达量最高，显示出二者在叶片脂肪酸合成中的重要作用。

3 讨论与结论

花生是我国重要的油料作物，但是花生油的价值和品质没有橄榄等植物的油高，所以提高花生油品质成为了人们关注的重点。FAT能够控制种子油脂肪酸组成和脂肪酸含量，所以对其进行深入研究可以为调控花生油脂肪酸组成提供一定理论基础。本研究对花生基因组中19个AhFAT基因进行了全面的生物信息学分析，发现AhFATAs和AhFATBs且都具有保守的Acyl-ACP_TE结构域，表明两个亚家族的基因具有相似的功能[13]。序列比对发现两个亚家族的N端序列相似很低，由此推测N端的不同可能会造成它们的底物偏好性不同，这与王威浩等[7]发现植物FAT氨基酸序列的N端不保守性可能是进化过程中植物根据自身特点所作出的选择这一结果相似。序列比对还发现AhFAT个别序列的天冬酰胺N和组氨酸H与有关报道中三个保守氨基酸催化位点有所不同，这两个位点的变化可能会导致AhFAT催化活性的变化[28]。系统进化树分析发现AhFATs分为AhFATA和AhFATB两个大分支，FATA家族成员相对FATB家族成员少很多，仅占整个家族的30.5%，而且FATB家族的分支也比较复杂，由此推测FATB具有不同的进化途径而造成FATB家族成员较多[29]。AhFATA和AhFATB与不同植物的FATA和FATB分别聚集在一起，说明AhFAT的进化与其它植物进化类似[30]。

选择性剪接是真核生物基因功能调控的一种重要方式。它在每一个生物过程中都起着重要作用，包括调节细胞分裂和细胞死亡，调控胚胎和成体组织的分化，以及细胞对各种环境因素的反应[31]。对花生转录组数据分析发现，19个AhFAT基因只有少数产生了剪接事件，且在特定组织中发生，这与周晏秋[32]对猕猴桃组织特异性可变剪接事件研究结果相似。本研究发现AhFATA家族两个基因在花生四个组织都发生可变剪接，且发生的种类多，说明这两个基因的表达可能会受到可变剪接的调控[33，34]。

研究基因的表达模式对于了解基因的功能具有重要意义。利用转录组数据对AhFAT家族基因的表达模式进行分析发现，AhFATAs和AhFATBs都在种子发育后期表达量较高，推测AhFAT家族基因对调控花生种子油脂积累具有重要作用[24]。这与拟南芥中FATA活性降低后虽然没有引起形态突变，但是导致拟南芥种子的含油量降为野生型含油量的50%的结果相一致[3]。陈高在研究AhFAT基因表达模式时发现AhFATB1基因在花中表达量最高；在花生果针入土第70天的种子中表达量达到最高峰[24]。AhFATB家族基因中Aradu.ZG6C0和Araip.SBA9Y在叶中表达量最高，表明其与叶片中脂肪酸合成相关。这个结果与先前拟南芥中FATB基因断裂导致茎和叶中蜡质和磷脂含量降低的结果相符[15]。

参 考 文 献：

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