转AhDREB1基因花生T2代植株耐盐性分析

郭瑞杰 李文 刘风珍 张昆 万勇善

摘要： DREB1 （dehydration responsive element binding protein） 是植物中特有的一类转录因子，在调控与逆境诱导相关基因的表达、参与植物对盐胁迫的响应及适应过程中具有重要作用。本研究以转AhDREB1基因T2代花生植株及其受体品种丰花2号（对照）为材料，苗期用1% NaCl 进行盐胁迫处理，分析胁迫前后植株表型和基因表达变化，并对SOD、POD活性和MDA、可溶性蛋白含量等生理指标进行测定。结果表明：盐胁迫下，转基因植株叶片保绿程度及根系生长状况明显好于对照。转基因植株DREB1基因表达量升高、响应盐胁迫速度比对照快。转基因植株参与盐胁迫响应的SOD、POD活性和可溶性蛋白含量高于对照，MDA含量低于对照，说明AhDREB1基因过量表达能有效提高花生的耐盐性。筛选出耐盐性较好的转基因单株4个，分别是D254、D380、D385、D448。

关键词：花生；DREB1；表型；表达量；生理指标；耐盐性

中图分类号：S565.201文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）06-0072-07

Abstract As a specific transcription factor in plants， DREB1 （dehydration responsive element binding protein） plays an important role in regulating the expression of stress-induced related genes and involves in the response and adaptation of plants to salt stress. In this study， T2 transgenic peanut plants of AhDREB1 and its receptor Fenghua 2 （control） were used as the materials. The seedlings were conducted salt stress treatment with 1% NaCl， and the changes of phenotype and gene expression before and after stress treatment were analyzed. The physiological indexes such as activities of SOD and POD， contents of soluble protein and MDA were measured. The results showed that under salt stress， the green degree and root growth of transgenic plants were better than those of control. The expression level of DREB1 in transgenic plants increased and the response to salt stress was faster than that of control. The activities of SOD and POD and the content of soluble protein of transgenic plants were higher than those of control， and the content of MDA was lower. These results indicated that overexpression of AhDREB1 could enhance the salt tolerance of transgenic peanut plants. Four transgenic plants with better salt tolerance were screened， namely D254， D380， D385 and D448.

Keywords Peanut； DREB1； Phenotype； Expression quantity； Physiological index； Salt tolerance

鹽碱土在全球范围内分布广泛，约有 100×108 hm2土地受到不同程度盐渍化的威胁[1]。我国盐渍土地面积约占全球的1/10[2]，占全国耕地面积的6.2%。土地次生盐碱化面积的不断增加已成为制约我国农业可持续发展的重要因素之一。花生是重要的油料、经济和蛋白质作物，目前关于花生耐盐及盐胁迫下体内离子平衡调节及适应机制的相关研究较少[3]。利用现代生物技术手段培育高耐盐碱花生新品种对盐碱地开发利用、增加农民收入具有重要意义。

DREB是一类植物特有且含有1个高度保守AP2结构域的转录因子，属于 AP2/EREBP（AP2/ethylene-responsive element-binding proteins，乙烯应答元件结合蛋白）家族。Stockinger等[4] 首次从拟南芥中克隆到编码 DREB 蛋白的CBF1基因。Liu等[5]首次从拟南芥中克隆到编码DREB蛋白的DREB1A和DREB2A基因。Lucas等[6]发现在逆境胁迫下DREB类转录因子特异性的与抗逆相关基因启动子区的DRE/CRT等顺式作用元件结合，激发下游靶基因过量迅速表达，使植物体内渗透调节物质和抗氧化酶活性增加，有效提高了植物对高盐、低温、干旱等的耐受性。Li等[7]从耐干燥的苔藓中分离到新型A-5类DREB基因ScDREB8并在拟南芥中进行过表达研究，表明通过正调控下游胁迫相关基因的表达和提高活性氧清除能力，可使盐胁迫下拟南芥的萌发率和幼苗期耐盐能力得到显著提高。刘强等[8]对拟南芥进行DREB基因转化，证实转基因拟南芥的高盐耐受性、抗旱性均比野生型植株增强。研究表明，超表达DREB1A/CBF3、 DREB1B/CBF1 和 DREB1C/CBF2这三个基因中的任何一个都显著提高转基因拟南芥对冰冻、干旱和高盐的耐受性[5， 9， 10]。在不影响植株正常生长的情况下，转GmDREB2基因大豆对干旱和高盐胁迫的抗性增强[11]。同样在胁迫诱导RD29A启动子控制下，过表达OsDREB2A基因的转基因水稻也表现出对干旱、高盐耐受性的提高[12]。

张梅等[13]发现花生的PNDREB1（GenBank登录号为FM955398）能被低温强烈、迅速诱导表达，并对干旱胁迫也有一定程度的响应。李文[14]对花生AhDREB1研究发现，干旱胁迫下不同品种基因表达量的差异直接影响下游抗旱相关基因的表达，决定了品种抗旱性。翟迎慧[15]得到转AhDREB1基因植株的基因表达量显著高于对照，干旱胁迫下，转基因植株的脯氨酸含量和SOD、POD、CAT等酶活显著高于对照，MDA含量显著低于对照，说明存在干旱胁迫响应应答。

目前转录因子DREBD功能验证大部分是在模式植物拟南芥和烟草中进行耐盐胁迫响应应答研究，在花生中则主要是干旱胁迫响应情况，对DREB1基因在花生耐盐性及耐盐性状的分析研究较少。本研究以转AhDREB1基因花生T2代植株为材料，分析盐胁迫下的植株表型和基因表达情况，并对SOD、POD活性、MDA和可溶性蛋白含量等生理性状进行测定，探讨AhDREB1基因编码的转录因子与花生植株耐盐性的关系，以期为研究DREB1基因在盐胁迫下的生理功能及适应机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

本试验PCR鉴定所用T2代单株源自转DREB1基因的花生T1代种子。具体获取方法：课题组前期构建了含有花生DREB1基因的过表达载体pGBDREB1[16]，通过农杆菌介导法导入栽培种丰花2号[14]，留种得到T1代转基因种子。

本试验所用转DREB1基因的T2代幼苗由前期PCR鉴定得到，用作盐胁迫处理，分析植株表型、基因表达及进行生理性状测定。

所有试验均以丰花2号为对照（CK）材料。

超快新型植物 RNA 提取试剂盒（GK 系列）购自北京华越洋生物科技有限公司；SYBR Premix EX Taq（Perfect Real Time）、 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit均购自宝生物工程有限公司（TaKaRa）；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 T2代转DREB1基因花生植株的PCR鉴定 采用上层育苗盘中河沙固定苗、下层水培盒中营养液提供营养的沙水结合方法种植T1代种子，单粒播，置于25℃、16 h光照条件下。待T2代植株长到两片真叶展开时，用改良1/5 Hoagland营养液进行培养，出苗7 d后编号，摘取幼叶进行基因组 DNA的PCR检测，以确定转基因单株。PCR鉴定标记基因bar所用引物：bar-F：5′-GTCTGCACCATCGTCAAC-3′；bar-R：5′-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3′。

1.2.2 T2代转DREB1基因植株的盐胁迫处理 经PCR鉴定的T2代转基因植株培养至出苗21 d后，将维持转基因和对照植株生长的营养液更换为含有1% NaCl的营养液进行盐胁迫处理。

1.2.3 盐胁迫下T2代转基因植株表型鉴定 盐胁迫0、4 d时照相记录并观察转基因和对照植株的表型变化。

1.2.4 盐胁迫下T2代转基因植株表达量鉴定 盐胁迫0、1 h时取幼嫩叶，液氮冷冻，荧光定量PCR检测AhDREB1基因表达量变化。具体操作步骤如下：

荧光定量模板cDNA的获取：参照华越洋RNA快速提取试剂盒（GK系列）操作步骤并加以优化进行花生叶片总RNA提取操作，并按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒操作说明进行RNA反转录获得cDNA链。

荧光定量PCR特异引物为qDREB-F：5′-AATGTGGCTCGGAACTTAC-3′；qDREB-R：5′-GATTGGCTACGGCTTCAT-3′。18S rRNA作为内参基因：18S rRNA-F：5′-GAAACGGCTACCACATCCAAG-3′；18S rRNA-R：5′-CCAACCCAAGGTCCAACTACG-3′。

參照宝生物试剂盒SYBR Premix EX Taq说明配制20 μL的qRT-PCR反应体系，采用两步法进行定量反应。条件为： 95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，40个循环；60～95℃ 每0.3℃收集一次荧光信号。在ABI Step One Plus实时荧光定量PCR仪上进行扩增。

1.2.5 盐胁迫下T2代转基因植株生理性状的测定 盐胁迫0、6 h时取功能叶，液氮速冻，用于超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）、可溶性蛋白含量等生理性状的测定。其中， SOD活性采用氮蓝四唑光还原法（NBT）进行测定[17]； POD活性采用愈创木酚法进行测定[18]； MDA含量采用硫代巴比妥酸法（TBA）进行测定[17]；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法进行测定[19]。

1.3 数据处理

利用Microsoft Excel 2003处理数据并作图。

基因相对表达量=2-△△Ct [注： -ΔΔCt=-（ΔCt，a-ΔCt，b），Ct：荧光阈值；a：目的基因AhDREB1；b：内参基因18S rRNA ]；

相对值=盐胁迫后生理性状测定值/盐胁迫前生理性状测定值；

增幅=盐胁迫后生理性状测定值-盐胁迫前生理性状测定值。

2 结果与分析

2.1 T2代转DREB1基因花生植株的PCR检测

试验以157个T2代单株的叶片基因组DNA为模板进行PCR扩增。扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性单株DNA扩增出分子量是424 bp的特异性目的条带（图1所示部分阳性单株），试验共获得24个转DREB1基因花生单株。

24株转基因单株被用于下一步鉴定盐胁迫相关的生理性状变化，其遗传关系如表1所示。

2.2 盐胁迫下T2代转基因植株表型变化

盐胁迫0 d时，T2代转基因植株与丰花2号（CK）植株长势旺盛且基本一致，植株的功能叶和老叶颜色呈深绿色，幼嫩叶及未展开叶颜色呈嫩绿色（图 2A）。盐胁迫4 d 后，植株生长状况如图 2B 所示。转基因植株和CK植株均出现了不同程度的叶片萎蔫失绿变黄现象。转基因植株萎蔫程度低，叶片保绿程度明显高于对照；整株出现真叶闭合的感夜运动；植株的未展开叶受盐胁迫伤害较小，衰老叶黄斑点逐渐由边缘向中心蔓延，多数功能叶颜色呈绿色；虽然植株根系颜色变黄并且侧根数目减少，主根根尖部位颜色些许变褐，但整体生长状态较好。CK植株受盐胁迫伤害程度大于转基因植株，表现在CK的主茎及侧枝的功能叶片已经枯萎下垂，叶片存活数少于转基因植株，部分叶片基部颜色呈发黄趋势；主茎变褐色，根系颜色变成黑褐色，侧根长及侧根数目明显低于转基因植株。

2.3 盐胁迫下T2代转基因植株中AhDREB1基因表达量分析

盐胁迫0 h时，转基因植株（D146除外）中AhDREB1基因的表达量均高于CK；AhDREB1基因在不同转基因单株的本底表达水平不尽相同，D380中表达量最高，是CK的 50.2 倍。盐胁迫1 h后，转基因植株和CK中AhDREB1 基因的表达量均上调，说明AhDREB1基因受盐胁迫诱导；CK中AhDREB1基因的表达量增幅0.53，是胁迫0 h时的1.53倍；87.5%的转基因植株中AhDREB1基因的表达量增幅在1.78～14.54，其中D254单株响应盐胁迫速度最快，增幅达14.54，而D188以较缓慢的速度响应盐胁迫（图3）。

2.4 盐胁迫下T2代植株耐盐相关生理性状分析

2.4.1 SOD 活性变化 盐胁迫0 h时，转基因和CK植株中SOD活性存在差异。大部分转基因植株的SOD活性高于CK。盐胁迫6 h后，转基因和CK植株中 SOD活性几乎都升高，其中D448中SOD 活性明显高于CK，酶活升高率是CK的3.2倍，并且比胁迫0 h时升高了 254个酶活性单位，而D151中 SOD活性是CK的1.94倍（图4）。

2.4.2 POD活性变化 盐胁迫0 h时，转基因植株的POD活性显著高于CK，其中D254的POD活性是CK的3.7倍。盐胁迫 6 h后，除D453、D184和D242外，其它植株中 POD活性都明显升高；不同转基因植株的POD活性升高了1.03～2.08倍，以D151叶片的POD 活性增幅最高，达12.7个酶活单位，是胁迫0 h的2.08倍；CK仅升高了1.4个酶活单位（图5）。

2.4.3 MDA 含量变化 盐胁迫0 h时，转基因植株的MDA含量与CK相比均处于低水平状态。盐胁迫6 h后，所有植株叶片细胞膜的膜脂过氧化水平都上升，膜系统受到伤害，但丙二醛含量增加幅度在植株間存在差异；CK叶片的MDA含量增幅是2.4，相对值是1.33；转基因植株的MDA含量增幅范围为0.05～2.06，多数转基因植株的MDA 含量增幅都远低于CK（图6）。

2.4.4 可溶性蛋白含量变化 盐胁迫0 h时，75%的转基因花生植株叶片中可溶性蛋白含量高于CK，其中D448的可溶性蛋白含量为10.4 mg/g，是CK的3.5倍；但D329的可溶性蛋白含量仅是CK的0.64倍。盐胁迫6 h后，转基因花生植株的可溶性蛋白含量均明显增加，但增加速度存在差异； D153中可溶性蛋白含量升高速度最快，是胁迫0 h的2.5倍，胁迫后的CK仅升高了0.25 mg/g，相对值是1.08（图7）。

3 讨论与结论

本试验在课题组前期获得转AhDREB1基因T1代花生植株的基础上，以T2代转基因单株为材料进行研究。发现盐胁迫0 h时，T2代转基因植株中AhDREB1基因表达量高于丰花2号（CK），盐胁迫1 h后，转基因植株响应盐胁迫速度比CK快。盐胁迫 4 d 后，高盐抑制了CK的根部和地上部生长，转基因植株叶片保绿程度及根系生长状况明显优于CK。证实DREB1基因在花生耐盐通路中发挥了一定的作用。Bouaziz等[20]证明与野生型相比，转StDREB1基因过表达的马铃薯植株具有较强的耐盐抗旱性。这也与本试验结果证实DREB1转录因子基因参与盐胁迫响应应答一致。

酶促系统能降低植株体内活性氧含量，从而延缓植株衰老，提高抗性。SOD 是活性氧清除系统中首要发挥作用的抗氧化酶，作用于活性氧大量生成的部位催化超氧离子的歧化反应，SOD与POD等协同抵御过氧化物自由基对膜系统的损害[21]，在逆境中保护植物细胞膜。研究证明各抗氧化酶酶活与植物耐盐性呈正相关[22， 23]。本研究得出转AhDREB1基因花生植株的 SOD、POD活性和可溶性蛋白含量在盐胁迫6 h 后均高于CK，MDA含量低于CK，表明转基因植株的质膜损伤程度低于CK。转基因单株D380、D385中AhDREB1基因表达量在胁迫前后都高水平表达，盐胁迫0 h时，其SOD、POD 活性和可溶性蛋白含量均高于CK，在经盐处理6 h后，其MDA含量低于CK，SOD、POD和可溶性蛋白性状检测值均高于CK。由于转基因单株遗传背景的差异致使单株间基因表达量和盐胁迫相关生理性状检测值出现显而易见的差异，即使同属一株系如16D287-2株系中的9个阳性单株间也存在差异，推测是由外源片段插入位点不同所造成，有待于进一步试验确认。综上结果分析，推测AhDREB1基因超表达能够提高转基因花生植株对盐胁迫的耐受性。

本试验从转基因T2代单株的盐胁迫后表型、AhDREB1基因表达量和抗氧化酶系统等相关分子及生理性状变化中筛选出耐盐性较好的4个转基因单株，分别是D254、D380、D385和D448，为深入研究DREB1转录因子调控下游靶基因表达及其耐盐网络的构建提供了材料。

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