高效液相色谱法测定板蓝根颗粒中腺苷的含量

王亚芳，钟昆芮，李应超，周艳飞，张小飞，高 婷，秦俊杰，王海军，战 皓*

(1.北京市兽药监察所，北京 100107； 2.北京生泰尔生物科技有限公司，北京 102206； 3.北京市中兽药工程技术研究中心，北京 102206)

板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort. 的干燥根，具有清热解毒、凉血利咽的功效，主要包括吲哚类、喹唑酮类、芥子苷类、有机酸类和核苷类等化合物[1-3]。板蓝根颗粒由单味药材板蓝根经提取、浓缩、加工而成，我公司根据《中国药典》2015版一部中板蓝根颗粒处方提取制备成便于临床应用的新兽用产品，清热解毒，凉血利咽，用于治疗鸡传染性法氏囊病，猪风热感冒等症。兽用板蓝根颗粒市场基数大，生产企业鱼龙混杂，存有企业在原材料收购、饮片加工和成药生产过程中不规范环节，导致产品质量参差不齐，无法保证药效，需要制定一种质量标准对板蓝根颗粒的产品质量进行控制。

板蓝根中核苷类成分，尤其是腺苷，具有抗炎、抗凝血、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌、镇静中枢神经和抗心律不齐的作用，可以通过参与并干扰细菌病毒的基因表达过程，从而起到一定的抗病毒作用[4-7]。《中国药典》中仅以亮氨酸、精氨酸为对照作为定性鉴别项，无质量控制标准。为了更好的控制板蓝根颗粒的质量，本研究将活性成分腺苷作为指标性成分，对其含量测定方法进行研究，为进一步完善板蓝根颗粒的质量控制提供了依据。

1 材 料

1.1 仪器 Waters1525高效液相色谱仪，2487双通道可调波长紫外检测器，美国waters公司；Symmetry C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，美国waters公司；KQ-500B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试药 板蓝根颗粒批号：080305、080307、080310、080312、080315、080317、080320、080322、080324、080326，北京生泰尔技术研究院试制产品；腺苷对照品，批号：110879-200202，购于中国药品生物制品检定所；甲醇(色谱纯)；双蒸水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Symmetry C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(10∶90)；检测波长：260 nm；流速：1.2 mL/min；柱温：30℃。

2.2 对照品溶液的制备 称取腺苷对照品约10 mg，精密称定，置50 mL的容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，滤过，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品内容物，研细，精密称定2 g，置具塞三角瓶中，加20 mL水超声处理15 min，取出，放置至室温，过滤，滤液转移至25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.4 线性关系考察 精密量取腺苷对照品储备液，逐级稀释得到浓度分别为4、8、12、16、20 μg/mL的溶液，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过。按上述色谱条件分别进样20 μL，测定峰面积。以腺苷浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示腺苷浓度在4～20 μg/mL内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程y=71169x-6732，R2=0.9999。

2.5 精密度试验 精密吸取腺苷对照品溶液20 μL，在上述色谱条件下重复进样6次，测定峰面积，并计算相对标准偏差(RSD)，试验结果见表1。经过计算，RSD=0.06%，表明该方法精密度良好。

表1 精密度试验测定结果 (n=6)Tab 1 Precision test results (n=6)

2.6 重现性试验 称取板蓝根颗粒粉末，在不同实验室分别由6个分析人员，平行制备6份供试品溶液，分别测定，根据峰面积值，计算腺苷含量及RSD值，试验结果见表2。结果显示腺苷平均含量为0.184 mg/g，RSD为1.50%，表明该方法重现性良好。

表2 重现性试验结果(n=6)Tab 2 Reproducibility test results (n=6)

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12 h进行测定。根据峰面积值，计算腺苷含量及RSD值，见表3。结果显示腺苷平均含量0.180 mg/g，RSD为0.43%，表明供试品溶液在12h内稳定。

表3 稳定性试验结果(n=6)Tab 2 Stability test results (n=6)

2.8 加样回收率试验 取已知含量的板蓝根颗粒样品6份，每份约1.0 g，精密称取，分别精密加入适量腺苷对照品，按上述样品溶液制备方法和色谱条件测定峰面积，计算腺苷的加样回收率及RSD值，结果见表4。结果显示，腺苷的平均加样回收率为96.62%(RSD=1.08%)。

表4 加样回收率实验结果(n=6)Tab 4 Experimental results of recovery

2.9 样品测定 取10批板蓝根颗粒样品，分别按上述样品溶液制备方法和色谱条件，测定峰面积，计算腺苷含量和RSD值，含量测定结果见表5，色谱图见图1。由表5可知，板蓝根颗粒中腺苷的含量为0.182 mg/g(RSD=1.52%)；图1所得到的液相色谱图峰型较对称，分离度高，保留时间适当。表明该方法灵敏度高、重现性好且稳定。

表5 板蓝根颗粒中腺苷含量测定结果(n=3)Tab 5 Determination of adenosine content in Banlangen Granule(n=3)

(a：腺苷)(a: adenosine)图1 腺苷对照品(A)及供试品溶液(B)色谱图Fig 1 Chromatograms of adenosine(A)and sample(B)of Banlangen Granule

3 讨论与结论

3.1 流动相比例的考察 本研究分别考察了甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液以12∶88，10∶90 比例下的色谱效果。当甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液比例为12∶88时，腺苷的保留时间为15.8min，但色谱峰容易受到杂质峰干扰；将比例稍作调整，当比例为10∶90时，腺苷保留时间为17.3 min，腺苷峰分离度高，故选择流动相为甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(10∶90)。

3.2 流速的考察 本研究分别以流速0.8、1、1.2 mL/min进行优选。当流速为0.8 mL/min时，腺苷的保留时间为27.3 min，出峰较慢；当流速为1.0 mL/min时，腺苷保留时间为20.9 min，出峰时间较理想，但有拖尾现象；当流速为1.2 mL/min时，腺苷的保留时间为17.3 min，腺苷峰分离度高且保留时间适宜，故选择流速为1.2 mL/min。

3.3 测定结果分析 本研究对10批板蓝根颗粒样品中腺苷的含量进行了测定，由测定结果可知，同一批样品腺苷含量较稳定，且10批样品腺苷含量范围为 0.178～0.188 mg/g，表明板蓝根颗粒制备方法稳定、重复性能较好。同时，以相同制备方法和色谱条件对3个厂家的兽用板青颗粒中腺苷含量进行检测，结果显示，腺苷含量范围为0.006～0.098 mg/g，不同厂家样品中腺苷含量差异显著，其内在质量差异较为明显。

本研究所建立的含量测定方法，腺苷与板蓝根颗粒中其他组分可以得到较好的分离，实验操作简单、快速、稳定且重复性良好，同时为板蓝根颗粒的质量控制提供了一种新方法。此外，板蓝根颗粒中有效成分众多，如何更全面的反应板蓝根颗粒的内在质量，研究报道甚少，亦有待进一步研究。