有氧运动对糖尿病前期人群血浆代谢物的影响

2018-08-13李博文贾冕张宁宁李超君王艳张献博周誉王正珍

中国运动医学杂志 2018年4期

李博文贾冕张宁宁李超君王艳张献博周誉王正珍

1北京体育大学运动医学与康复学院（北京 100084）2北京医院内分泌科，国家老年医学中心 3中国教育科学研究院

糖尿病前期（pre-diabetes mellitus，PDM）是由健康状态进展为糖尿病的必经阶段。规律的运动可以改善PDM人群胰岛素抵抗状态和血糖水平，预防或延缓糖尿病的发生[1]，但其作用机制仍不清楚。近些年来，代谢组学分析在研究疾病发生和治疗效果方面逐渐发挥作用[2]，并且也逐渐被用于运动科学领域的研究，有学者将其定义为“运动代谢组学”[2]。目前，运动干预慢性疾病的代谢组学研究尚处于起步阶段，且鲜有运动干预对PDM人群的代谢组学研究报道。因此，本研究利用液相色谱质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技术对PDM人群在有氧运动干预前后的血浆代谢物进行代谢组学分析，探寻PDM人群与有氧运动相关的标志物，为探究PDM干预治疗的机制提供依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 纳入和排除标准

研究对象来自北京市某两所医院的体检中心和周围社区，对受试者进行口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）。纳入标准：1）年龄30～69岁；2）无冠心病、肾病等慢性疾病；3）未服用过降糖药物；4）收缩压＜160 mmHg，且舒张压＜100 mmHg；5）心血管危险分层后属中低危人群；6）同意并签署知情同意书者。排除标准：1）试验期间服用降糖药物者；2）不能坚持完成全程试验者。本研究方案通过北京体育大学伦理委员会审查（批准号：2016012）。

PDM和 2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）诊断采用我国糖代谢状态分类标准[3]：空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）≥7.0 mmlo/L 和/或OGTT 2h血糖（2 hours plasma glucose，2hPG）≥11.1 mmlo/L定义为T2DM；FPG 在6.1～6.9 mmlo/L为空腹血糖受损，2hPG在7.8～11.1 mmlo/L为糖耐量减低，空腹血糖受损和糖耐量减低统称为PDM。

1.1.2 分组

根据OGTT筛查结果确定受试者血糖正常（NGT）组10例、PDM组25例、新发T2DM组10例。采用信封法将PDM组受试者随机分为健康教育对照组12例、有氧运动结合健康教育组13例，最终健康教育对照组有1例因出差失访脱落，其余受试者均完成全部试验，受试者信息见表1。

表1 血糖水平不同的受试者基本信息和血糖情况

1.2 研究方法

1）比较不同血糖状态受试者血浆代谢物差异；2）对PDM受试者分别进行为期12周的健康教育或有氧运动结合健康教育干预，比较干预前后血浆代谢产物差异。

1.2.1 一般资料和危险分层

采用体力活动准备问卷（physical activity readiness questionnaire，PAR-Q问卷）和美国心脏协会/美国运动医学学会健康机构运动前筛查问卷的综合改良问卷[4]对受试者进行心血管疾病危险分层。

1.2.2 形态学和身体成分

空腹测量身高、体重、围度等形态学指标，保留1位小数。身体成分测试采用双能X线法（Norland XR-600，美国），记录全身脂肪含量（记录精确到0.1 kg）和体脂百分比精确到（1%）。按照公式BMI（kg/m2）=体重（kg）/身高（m）2计算体重指数（body mass index，BMI）。

1.2.3 心肺耐力

心肺耐力采用直接测试法（KORR Cardio Coach，美国）；环境要求：室温为20℃～25℃，湿度为40%～60%，环境安静。功率自行车（Ergosana XC1000，德国）递增负荷试验，25 W起始，60转/分，每3 min增加25 W，按照美国运动医学会推荐标准终止运动试验[5]，平均完成时间为12.01±3.48 min。

1.2.4 血液生化指标

受试者空腹10小时，采血测FPG、2hPG、糖化血红蛋白（hemoglobin A1C，HbA1c）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。FPG、2hPG、TC、TG、HDL-C和LDL-C的检测采用AU5800全自动生化分析仪（Beckman Coulter，美国）；HbA1c检测采用VARIANTⅡ血红蛋白仪（Bio-Rad，美国）。

1.2.5 血浆代谢组学检测

①实验试剂：LC-MS级乙腈（Merck，德国），HPLC级甲醇（Merck，德国），甲酸（CNW，德国）。其他试剂均为市售分析纯。实验用水为屈臣氏蒸馏水。

②样本处理：将血清加入10倍沉淀剂沉淀蛋白，10000转/分离心10 min，取5 μL进样，进行LC-MS分析。

③色谱-质谱分析条件

色谱分析采用超高效液相色谱仪（Ultimate 3000，DIONEX，美国），ACQUITY BEH-C18色谱柱（1.7 µm，2.1×50 mm）。液相条件：A相为水（含2 mmoL/L甲酸铵和0.1%甲酸），D相为乙腈；梯度洗脱，分析时间0～18 min，进样量5 μL，流速0.25 mL/min。

质谱分析采用四极杆-轨道阱高分辨杂交质谱仪（Q EXACTIVE，Thermo，美国）。正负离子模式，离子源喷雾电压为2800 V；蒸发温度为350℃；鞘气为35Arb；辅助气为10Arb；毛细管温度为350℃；S-lens-RF为50。一级全扫描：分辨率为70000；AGC target为1e6；Maximun TT为100 ms；扫描范围为70～1050 m/z。二级数据依赖性扫描：分辨率为35000；AGC target为1e5；Maximun TT为50 ms。

1.3 干预方法

①健康教育：以宣教的形式，对PDM受试者（运动组和对照组）进行预防糖尿病的健康教育。

②运动处方：运动形式以快走或慢跑为主，结合健身操和游泳等。第1～4周，强度为40%～50%储备摄氧量（oxygen uptake reserve，VO2R），第5～12周强度为50～60%VO2R。运动频率为每周3次，每次50 min。每次运动的准备和整理活动各5 min。

③运动干预的实施和监督：运动干预的实施、监督由项目组监测人员完成。监测人员在项目开始前进行集体学习和培训，每位监测员负责一定数量受试者的运动监督、管理和数据收集及整理工作。采用心率和主观疲劳感觉（ratings of perceived exertion，RPE）（Brog评分在“11～13分之间”，即“尚且轻松”到“有些吃力”之间）监测运动强度。对受试者进行自我监督的培训，培训包括使用指夹式脉搏血氧仪和RPE表监控强度，用调整步频达到处方强度要求的心率的方法，运动日记的记录方法等。第1～4周，每次锻炼课在监测者的现场监督下完成。第5～12周，采取监测者远程监督与受试者自我监督相结合的方法实施运动处方。建立受试者微信群，每周至少1次在群里鼓励受试者。监测者每周以微信或电话的形式联系受试者，询问运动处方执行情况，并要求受试者提供当周运动日记（包括每次锻炼的时间、内容、心率，锻炼时的步频和步数、RPE、意外损伤、患病、未能按时完成锻炼任务的原因等）和计步器的照片，研究者进行记录，将不能按照运动处方完成锻炼者视为缺勤，对缺勤者进行强化管理（鼓励、教育、增加联系频率、在监督下锻炼等），对出勤良好者给予口头鼓励和赠送小礼品等。缺勤超过75%者终止试验。

1.4 统计学处理

研究结果用均数±标准差（M±SD）表示。采用SPSS 22.0统计软件对数据进行正态分布检验，采用配对样本t检验比较干预前后组内差异，独立样本t检验分析组间差异。不满足正态分布的数据进行对数转换后再行分析。变化率=（干预后-干预前）/干预前。P＜0.05为差异有统计学意义。

利用Tracefounder软件对LC-MS数据进行预处理，获得变量（保留时间-质荷比）、分子量、观察量和峰强。将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P软件（11.0）进行偏最小二乘法判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）。基于变量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）＞1.0，且t检验P＜0.05筛选差异性代谢物。

2 结果

2.1 内源性代谢物的鉴定

利用精确质量数达到小数点5位的精确程度并利用分子量和分子式确定每个内源性物质，同时在Tracefounder软件中建立内源性物质的数据库用于定性分析样品中每个内源性物质，对每个内源性物质的峰面积与相应内标峰面积进行对比获得相对的含量比值，用来进一步分析内源性物质的变化规律。见图1。

2.2 比较血糖状态不同的受试者内源性代谢产物的差异

比较PDM、T2DM组与NGT组受试者血浆代谢物，发现11种代谢物含量有差异，其中在PDM和T2DM组上调的有亮氨酸、缬氨酸、甜菜碱、亚油酸、油酸、花生四烯酸、乳酸、棕榈酸，PDM和T2DM组下调的有磷脂酰胆碱（phosphocholine，PC）和鞘磷脂（sphingomyelin，SM）（见表2）。

图1 A：正离子全扫描总离子流图；B：负离子全扫描总离子流图；C：缬氨酸色谱图；D：缬氨酸相应的精确质量数和分子式

表2 血糖状态不同的受试者差异性血浆代谢物

2.3 有氧运动对糖尿病前期受试者形态学的影响

与干预前相比，运动组的体重、BMI和体脂百分比明显降低（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）；与对照组相比，运动组体重变化率差异显著（P＜0.05），其他指标的变化无统计学意义，见表3。

表3 干预前后PDM受试者身体成分的变化

2.4 有氧运动对糖尿病前期受试者血糖和血脂的影响

与干预前相比，运动组的2hPG和LDL-C水平明显降低（P＜0.01，P＜0.05）；与对照组相比，运动组的LDLC变化率差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组2hPG明显升高（P＜0.01）；其他血生化指标变化无统计学意义，见表4。

表4 预前后PDM受试者血糖和血脂的变化

2.5 有氧运动使糖尿病前期人群血糖转阴情况

干预后，运动组9人血糖转阴，转阴率为69.23%，明显高于对照组（P＜0.01）。见表5。

表5 干预后PDM受试者血糖转阴情况

2.6 有氧运动对糖尿病前期受试者血浆内源性代谢物的影响

比较运动后与运动前PDM组血浆代谢物，干预前后区分开，发现31种差异性物质，其中上调物质25种，包括溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LysoPC）、PC、亚油酸、SM等，下调物质包括油酸、胞嘧啶等6种（见表6、图2）。

表6 干预前后PDM受试者血浆主要内源性代谢物平均变化百分比

续表6

图2 PLS-DA模型分析运动前后PDM受试者血浆代谢物差异

3 讨论

本研究的主要目的是分析PDM人群在12周有氧运动干预前后血浆中小分子代谢物的变化，了解有氧运动对这类糖尿病高危人群的代谢影响。代谢组学检测是利用色谱和质谱技术了解由于外源性作用而引起内源性代谢产物的变化。常用技术包括核磁共振谱、质谱为核心的分析技术以及色谱质谱联用技术，不同方法各有优势。LC-MS能够分析高极性和分子量相对更高的化合物，更适用于代谢组学生物样本中复杂代谢物的检测和潜在标志物的鉴定。通过代谢组学分析可以得到氨基酸类、脂肪酸类、磷脂类和嘌呤嘧啶类等代谢物。利用代谢组学技术已发现多个胰岛素抵抗和T2DM的生物标志物。Guasch-Ferré等人对健康人和糖代谢异常人群血液的代谢组学差异物进行了Meta分析，涉及27项横断面研究和19项前瞻性研究，结果显示T2DM受试者血液中亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸含量高于健康人，并且甘氨酸和谷氨酸含量与T2DM风险呈负相关[6]。此外，油酸、PC、LysoPC、单糖等也被证明是在T2DM的预测和早期诊断方面有价值的生物标志物[7]。近年来，随着脂质组学的发展，有关脂质与糖尿病及其并发症的关系越来越受到国内外研究者的关注。

PDM是以胰岛素抵抗和胰岛素分泌异常为主要特征的代谢疾病，运动可以通过增加糖代谢和胰岛素信号通路中蛋白的表达来加强骨骼肌对胰岛素的应答、增加肌肉脂质储备和脂肪的氧化能力，从而提高胰岛素敏感性。不同的运动方式、强度和时间对健康或糖代谢异常者的血液生化指标、血浆代谢物会产生不同的影响[4，8]。2016年，美国糖尿病协会发布的《体力活动/运动与糖尿病：美国糖尿病学会立场声明》中建议：“对于糖尿病高危人群及糖尿病前期人群推荐进行生活方式干预，包括至少每周进行150 min的体力活动和饮食调整，超重和肥胖者减重5%～7%”[9]。本研究参考上述指南的推荐，对PDM受试者实施了为期12周的有氧运动（每周150 min中等强度）结合健康教育的干预。干预后，运动组受试者血糖转阴率达到69.23%（见表5），未转阴者的血糖也有不同程度的降低，运动干预使血糖转阴率与王正珍[10]、罗曦娟[4]等人对PDM人群进行12周有氧运动干预的研究结果一致（转阴率分别为62.5%和69.2%）。与干预前相比，运动组受试者的OGTT 2hPG平均降低16.22%，LDL-C平均降低9.2%（见表4）。运动干预对PDM受试者的血糖改善主要体现在2hPG显著降低，FPG和HbA1c改善不明显，分析可能的原因是本研究中PDM受试者血糖异常以2hPG异常更为显著，BMI较高（25.70 ± 2.20 kg/m2），但是FPG和HbA1c异常程度不高（见表1），并且干预后受试者的BMI明显降低，改善胰岛素抵抗，有利于降低2hPG。12周有氧运动改善了PDM受试者的部分糖脂生化指标，本实验进一步分析了PDM受试者血浆代谢物的变化。

通过对比有氧运动干预前后PDM受试者血浆代谢物的含量，发现干预前后血浆中磷酯、游离脂肪酸和氨基酸等31种差异代谢物，其中包括LysoPC（16：0）、LysoPC（18：0）、LysoPC（18：1）、LysoPC（18：2）、PC（14：1/22：1）和SM（d18：0/16：1）等10种磷脂（见表5）。LysoPC、PC、SM等磷脂类物质被证明与胰岛素抵抗和糖尿病发生有关[11，12]。磷脂包括甘油磷脂和鞘磷脂，甘油磷脂又称磷酸甘油酯，根据磷脂酸的磷酸羟基取代基团不同，又分为PC、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等。PC是细胞膜的组成成分，并在细胞内外的信息传递、能量代谢以及蛋白质锚定等生物过程中起重要作用。运动改善PDM受试者磷脂代谢的机制可能与磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，PLA2）活性改变有关。磷脂在PLA2的作用下可降解为溶血磷脂和脂肪酸，长期高血糖状态可激活蛋白激酶C，增强PLA2的活性，加速磷脂化合物的降解，导致体内磷脂水平降低。因此，推测PDM受试者通过规律运动，抑制PLA2活性，升高磷脂含量，改善胰岛素抵抗，降低2hPG水平。同时由于PLA2水解磷脂而产生游离脂肪酸，PLA2活性改变也会影响游离脂肪酸水平，T2DM和PDM组受试者血浆中游离脂肪酸升高的结果与这一推测相吻合，并且干预后PDM血浆中油酸含量降低可能也与上述机制有关。

在运动干预后，PDM受试者血浆中7种LysoPC含量上调（见表6）。LysoPC是人血液中的含量最丰富的溶血磷脂，LysoPC（18：2）被证明与T2DM和BMI有关[7]。本研究中，运动使PDM受试者血浆中LysoPC（18：1）和LysoPC（18：2）的含量分别达干预前的1.44倍和1.05倍（见表6），受试者的体重和体脂百分比分别下降了2.78%和4.6%（见表5），规律运动可能通过调节LysoPC（18：1）和LysoPC（18：2）的代谢，改善PDM受试者的肥胖程度，有利于血浆代谢物向着良性方向改变。

本研究中，与血糖正常组相比，PDM组和T2DM组受试者血浆中油酸、棕榈酸、花生四烯酸含量上调，并且它们在血糖正常组、PDM组和T2DM组中的含量呈现递进增加的趋势（如油酸含量：NGT组＜PDM组＜T2DM组）（见表2）。12周的运动干预后，PDM受试者血浆中油酸含量下调。油酸被证明是与胰岛素抵抗和T2DM的发生有关的标志性代谢物[13]。血浆中高FFA状态可能会增加氧化应激，干扰胰岛素信号传导，影响葡萄糖的摄取和糖原合成[14]。有氧运动可能通过改善PDM受试者血浆中的油酸代谢，降低油酸的氧化应激和胰岛素抵抗作用，并且由于高FFA也会导致肝脏内脂类代谢，因此，运动后PDM受试者的糖脂代谢有所改善可能与油酸含量降低有关。

本研究还观察到有氧运动使PDM受试者血浆中胞嘧啶、丁烯肉碱的含量发生变化，它们可能与糖尿病肾病的发生有关[15]，但与运动的关系尚不清楚。此外，运动未改善缬氨酸[6]、棕榈酸[16]、2-羟基-3-甲基戊酸[17]等T2DM标志物的含量，这是否与受试者的其他生物学信息有关，仍需进一步研究探讨。建议今后研究扩大样本量，将非靶向和靶向代谢组研究方法结合起来分析，并结合动物模型进行更深入的通路研究。