有氧运动与复合多糖干预对高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道菌群的影响

沙继斌 张静 隋波 张成岗

1山东体育学院运动与健康学院（济南 250102）2军事医学科学院放射与辐射医学研究所（北京 100850）3苏州大学体育学院（苏州 215021）

近些年来肥胖与肠道菌群之间的关系逐渐得到证实。有研究表明，肠道菌群可有效调控宿主的代谢尤其是脂代谢，肠道菌群的平衡/失衡与宿主肥胖表型改变直接相关[1-4]。Cani等认为肠道菌群失衡所致内毒素（lipopolysaccharide，LPS）分泌增多是导致肥胖发生的重要诱因[5，6]。赵立平等则认为肠道菌群与肥胖之间的关系不仅密切相关，还可能存在因果关系[7-9]，肠道菌群尤其是特定菌种的改变可能是诱发动物及人体肥胖表型改变的直接诱因。Clarke等研究表明，运动可以显著提高肠道菌群的多样性，降低运动员体内的炎症反应[10]。已知有氧运动可有效促进脂肪的消耗，由此提示有氧运动同样可能通过增加菌群多样性，下调肠内炎性因子水平等来实现减脂控体重。目前有氧运动对肥胖个体肠道菌群影响的研究报道较少，其机制尚不清楚。

多种人体不能消化吸收的复合多糖在进入大肠后，可有效促进肠道内益生菌增殖，产生具有显著抗炎效应的短链脂肪酸[11]。由此推测复合多糖可能通过增加有益菌数量、抑制有害菌数量来调节失衡的肠道菌群，进而降低体内炎症反应，从而实现减脂控体重。前期研究发现高脂膳食诱导肥胖大鼠体重、Lee's指数及脂肪系数均有明显上升，有氧运动、复合多糖灌胃及二者的联合干预均可减重、减脂；高脂膳食诱导大鼠肥胖过程中同步伴有血脂代谢紊乱，炎症反应显著加剧；而有氧运动、复合多糖灌胃及二者的联合干预均可使血脂代谢改善，炎性因子水平显著降低；提示上述不同干预措施均能通过有效抗炎及改善血脂代谢以改变动物身体成分[12]。本研究在上述已知动物表型改变的基础上，同步分析上述干预措施对高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道菌群的影响，为进一步确证肠道菌群失衡可诱导肥胖发生的作用机理，寻求有效的减脂控体重措施提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 高脂膳食诱导肥胖动物模型建立及动物分组

健康雄性SD大鼠70只，体重117±15.4 g，购自军事医学科学院实验动物中心，动物许可证号：SCXK（军）2007-004。随机选取10只作为对照组，饲喂普通饲料；剩余60只饲以高脂饲料D12492，许可证号：SCXK（京）2014-0008，4周后参照刘利民、王从容等的研究结果[13，14]，选择体重大于对照组平均体重20%的大鼠作为肥胖大鼠，造模成功率约为70%。

选取造模成功的40只大鼠，将其随机分为肥胖对照组、有氧运动组、复合多糖干预组、有氧运动及复合多糖联合干预组，每组10只。

1.2 实验动物干预方案

1.2.1 有氧运动方案：依据陈文鹤等[15]研究结果选择中等强度跑台训练，跑台坡度0，初始速度自10 m/min开始，依次按照2.5 m/min速度递增，每级持续5 min，以此模式递增至15 m/min并维持此运动负荷，60 min/day，每周训练6天，共训练6周。每日定时按设定运动负荷对大鼠进行跑台训练。

1.2.2 复合多糖灌胃方案：以0.9%生理盐水将复合多糖（编号：ss0627）配制为浓度10%的溶液，以动物体重的0.5%作为灌胃剂量，于每日下午定时对大鼠进行灌胃干预，共持续6周。其余各组代以等量生理盐水。

1.3 肠道菌群样本取材

用10%水合氯醛（10 ml/kg剂量）腹腔注射麻醉大鼠，于结肠末端留取粪便2颗，置于-80℃超低温冰箱冻存，用于肠道菌群16S rDNA测序。

1.4 肠道菌群样本DNADNA的提取及1616S rDNA rDNA测序

1.4.1 肠道菌群样本DNADNA提取

使用粪便基因组DNA提取试剂盒（离心柱型DP328）进行提取，使用紫外分光光度计测定所提取DNA的OD260/OD280比值，将质量检测合格的DNA置于-80℃冰箱冻存待测。

1.4.2 1616S rDNA rDNA的扩增

对肠道菌群16S rDNA的V4区进行PCR扩增，上游引物序列：5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'；下游引物序列：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'；PCR扩增结束后，从每个样品中吸取100 ng（体积约5～10 μl）的PCR扩增产物，将每20个样品作为一个批次进行混样，充分混匀后浓缩体积至30 μl，2%浓度的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行纯化。

1.4.3 建库、上机测序及质控

利用美国Illumina公司的TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂盒完成建库[16]。使用荧光分光光度计对文库定量并通过Agilent高敏度核酸定量仪对PCR富集片段行质量监控并验证DNA文库；在Illumina MiSeq高通量测序平台上采用双末端测序法上机测序。

使用QIIME软件（V1.6.0，http：//qiime.org/index.html）对下机数据进行预处理，包括：①数据拆分；②Tags拼接；③Tags截取；④Tags长度过滤；⑤Tags去嵌合体序列。最终得到高质量的有效数据。所测得的每个OTUs的最长16S rDNA序列片段根据已有Greenbank数据库进行相似性比对（网址：http：//greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi）。

1.5 数据处理与统计分析

1.5.1 生物信息学分析

1.5.1.1ReadsReads数筛选及质控

对测序产生的序列采用FLASH软件数据包行paired-end reads拼接，依据引物条形码序列barcode定位于相应样本，对于测序质量较低的数据予以去除[17]。采用QIIME软件数据包行reads质控来挑选符合要求的高质量 reads，并去除低质量reads[18，19]。

1.5.1.2OTUsOTUs分析

采用QIIME质控器的操作命令将相似度大于97%的序列挑选出来并聚类为一个操作分类单位（operational taxonomic unit，OTU），同时生成OTUs矩阵[20]。

1.5.1.3物种注释

采用Ribosomal Database Project（RDP）软件数据包对OTUs的最长16S rDNA序列片行相似同源性比对和种属分类学鉴定[21]，数据库参照Greenbank（网址：http：//greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi）。统计各个样品在细菌科（family）、属（genus）、种（species）分类水平上的组成。

1.5.2 统计学分析

采用SPSS17.0统计学软件进行数据统计，数据结果以x±s表示，菌群分类数据组间差异采用秩和检验进行比较，显著性水平设为P＜0.05。

2 实验结果

2.1 各组别动物菌科分类水平上的肠道菌群丰度分布改变结果

如图1所示，与对照组相比，肥胖对照组大鼠肠道内瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）显著增加（P＜0.05）；梭菌科（Clostridiaceae）、苏黎世杆菌科（Turicibacteraceae）显著降低（P＜0.05）。

干预后，与肥胖对照组相比，有氧运动组大鼠肠道内产碱杆菌科（Alcaligenaceae）、双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）显著增加（P＜0.05）；螺杆菌科（Helicobacteraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）显著降低（P＜0.05）。与肥胖对照组相比，复合多糖干预组大鼠肠道内双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、韦荣氏球菌科（Veillonellaceae）、苏黎世杆菌科（Turicibacteraceae）显著增加（P＜0.05）；脱硫弧菌科（Desulforibrionaceae）、螺杆菌科（Helicobacteraceae）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）显著降低（P＜0.05）。与肥胖对照组相比，有氧运动及复合多糖联合干预组大鼠肠道内双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）显著增加（P＜0.05）。

2.2 各组别动物菌属分类水平上的肠道菌群丰度分布改变结果

如图2所示，与对照组相比，肥胖对照组大鼠肠道内双歧杆菌属（Bifidobacterium）显著下降（P＜0.05），苏黎世杆菌属（Turicibacter）数量显著下降（P＜0.01）。

干预后，与肥胖对照组相比，有氧运动组大鼠肠道内阿克曼氏菌属（Akkemansia）、别样棒菌属（Allobaculum）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、布劳特氏菌属（Blautia）均显著增加（P＜0.01）；罗斯拜瑞氏菌属（Roseburia）、萨特氏菌属（Sutterella）、苏黎世杆菌属（Turicibacter）数量也有显著上升（P＜0.05），普雷沃氏菌（Prevetella）数量有增加，无显著性差异。与肥胖对照组相比，复合多糖干预组大鼠肠道内双歧杆菌属（Bifidobac-terium）数量显著增加（P＜0.01），别样棒菌属（Allobacul um）、苏黎世杆菌属（Turicibacter）数量也有显著上升（P＜0.05）。与肥胖对照组相比，有氧运动及复合多糖联合干预组大鼠肠道内别样棒菌属（Allobaculum）、布劳特氏菌属（Blautia）、罗斯拜瑞氏菌属（Roseburia）数量显著增加（P＜0.01）。

图1 不同组别有差异菌科的相对丰度变化比较

图2 不同组别有差异菌属的相对丰度变化比较

2.3 各组别动物菌种分类水平上的肠道菌群丰度分布改变结果

如图3所示，与对照组相比，肥胖对照组大鼠肠道内布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）显著增加（P＜0.05）。

干预后，与肥胖对照组相比，有氧运动组大鼠肠道内嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）、粪便普雷沃氏菌（Prevetella copri）数量显著增加（P＜0.01，P＜0.05）；布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）数量减少，无显著性差异。与肥胖对照组相比，复合多糖干预组大鼠肠道内布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）数量显著减少（P＜0.05）。与肥胖对照组相比，有氧运动及复合多糖联合干预组大鼠肠道内布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）数量减少，无显著性差异。

3 讨论

3.1 高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道菌群组成的变化

图3 不同组别有差异菌种的相对丰度变化分析结果

肥胖个体体内存在肠道菌群数量比例及结构失调的现象[22，23]。本研究同样发现，高脂膳食可诱导大鼠肠道内菌群组成与比例发生深刻改变。在菌科水平，高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道内瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）比例显著增加；在菌属水平，高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道内双歧杆菌属（Bifidobacterium）与苏黎世杆菌属（Turicibacter）比例显著降低，双歧杆菌属（Bifidobacterium）可通过增强定植抗力，调节宿主免疫应答以预防感染性疾病。李兰娟研究证实双歧杆菌与肠球菌的比值（Bifidobacterium/Enterococcus Ratio，B/E）可简明的反映肠道菌群健康程度[24]。苏黎世杆菌（Turicibacter）是Bosshard等2002年在苏黎世分离得到的新型杆菌[25，26]，其生物学功能目前尚不清楚，推测可能与调节机体脂代谢有关。在菌种水平，高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道内布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）数量显著增加。瘤胃球菌（Ruminococcaceae）是已知与肥胖直接相关的菌群，肥胖个体肠道内其比例会显著上升[27-29]。

3.2 有氧运动对高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道菌群组成的影响

Matsumoto等通过比较自主转轮运动大鼠体内肠道菌群的变化发现：对照组和运动组大鼠的肠道菌群组成显著不同，且运动组大鼠肠道内肠道菌群的代谢产物丁酸盐的浓度显著升高[30]，提示运动引发了大鼠盲肠微生态环境的显著变化。Choi等研究表明，运动可以有效减轻服用多氯化联苯所引起的肠道菌群变化[31]。Evans等的研究表明，运动可改变实验鼠体内的肠道菌群，其体内拟杆菌门/硬壁菌门的比值与运动量呈负相关[32]。

本研究中，与肥胖对照组相比，在菌科水平，6周有氧运动可使高脂膳食诱导肥胖组大鼠肠道中双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）显著增加。双歧杆菌（Bifidobacterium）是功能已确认的益生菌[32]，可促进短链脂肪酸（short chain fatty acid，SFCA）的生成，可增强肠道粘膜上皮细胞的免疫屏障功能。与之相对应的是与肥胖呈正相关的瘤胃球菌（Ruminococcaceae）比例显著降低，由此提示6周有氧运动可以优化调节肥胖大鼠肠道菌群结构及数量比例。

在菌属水平，有氧运动可使高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道中阿克曼菌属（Akkermansia）、别样棒菌属（Allobaculum）、布劳特氏菌属（Blautia）、普雷沃氏菌属（Prevetella）数量增多。别样棒菌属（Allobaculum）、布劳特氏菌属（Blautia）可产生SCFA，而在补充高膳食纤维食物后，肠道中普雷沃氏菌（Prevetella）数量增加[33]。以上结果提示有氧运动有助于提升动物肠道菌群健康程度。

在菌种水平，有氧运动可使高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道中嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）数量显著增加。嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）是Derrien于2004年发现的可降解结肠内表面黏液凝胶层中粘蛋白的革兰氏阴性厌氧菌，在超过90%的成年个体肠道内均有定植[34，35]。Maria对49名超重或肥胖个体的比较发现：肠道中嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）含量较高的个体代谢状况更趋向于正常[36]。Clake等则发现优秀橄榄球运动员肠道内嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）所占比例较高[10]。Liou等发现进行胃旁路手术（gastric bypass）后的小鼠，其肠道内阿克曼氏菌（Akkermansia）的相对丰度快速持续增加[37]。Lukovac等发现嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）可影响细胞脂代谢当中不同转录因子及基因的表达，包括禁食诱导脂肪因子（fasting induced adipose factor，Fiaf）、SFCA的受体Gpr43及过氧化物增殖激活因子受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）等[38]。Reunanen等观察到嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）可有效增强细胞屏障的整体结构一体性，可使与之共培养的肠上皮细胞IL-8显著增高100倍，提示其具有明显的抗炎作用[39]。

同时，6周有氧运动使能够有效调节糖代谢的粪便普雷沃氏菌（Prevetella copori）数量显著增加，提示其可能通过影响菌群而改善宿主机体代谢[33]。与之相对应的是，6周有氧运动使高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道中布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）数量降低。

上述菌群结构组成的改变与我们之前所观察到的有氧运动对肥胖大鼠身体成分、血脂成分、血清炎性因子的作用趋势一致[12]，提示有氧运动调节优化大鼠肠道菌群与上述表型的改善之间存在密切内在联系。

3.3 复合多糖干预对高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道菌群组成的影响

复合多糖可以刺激肠道内有益菌的增殖、抑制有害菌的增殖，进而通过调整肠道内失衡的菌群达到控制体重的目的。de Silva等研究发现通过复合多糖干预后，实验动物肠道内双歧杆菌（Bifidobacterium）增加，同时体重下降[11]。Everard等通过给肥胖鼠喂食复合多糖，观察到肠道内硬壁菌门（Firmicutes）水平降低、拟杆菌门（Bacteroidetes）水平升高[40]。Parnell等研究发现，随着复合多糖摄入的增多，肥胖动物体内失衡的菌群结构逐渐得到恢复[41]。提示复合多糖通过调理失衡的肠道菌群，可降低体内的炎症反应，有效抑制肥胖的发生。

本研究结果显示，与肥胖对照组相比，在菌科水平，6周复合多糖干预组双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）数量显著增加，苏黎世杆菌科（Turicibacter）数量显著上升。Fukuda等利用多组学技术分析了双歧杆菌（Bifidobacterium）对肠出血性大肠埃希氏菌株大肠杆菌O157:H7（enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7）所诱导的致死性感染小鼠模型的作用，结果发现：长双歧杆菌（Bifidobacterium longum subsp.Longum，JCM 1217T）可有效抑制上述致病菌的作用[42]。同时6周复合多糖干预可促使与肥胖呈正相关的瘤胃球菌（Ruminococcaceae）比例显著降低，而与之同时产生内毒素的脱硫弧菌科（Desulforibrionaceae）也显著降低，与Cani等人的研究结果一致[43]。提示复合多糖干预对肠道菌群的优化改善作用方式与有氧运动的调节作用方式可能不同。

在菌属水平，6周复合多糖干预同样可促使双歧杆菌属（Bifidobacteriium）数量显著增加。在菌种水平，6周复合多糖干预可使布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）数量显著减少。

上述复合多糖干预对高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道菌群主要组成的影响与我们之前所观察到的复合多糖干预对肥胖大鼠身体成分、血脂成分、血清炎性因子的作用趋势基本一致[12]，提示上述表型的改变与复合多糖调节的大鼠肠道菌群优化改善之间存在密切内在联系。

3.4 有氧运动及复合多糖联合干预对高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道菌群组成的影响

与肥胖对照组相比，有氧运动及复合多糖联合干预组并未能取得实验设计中预想的可能叠加或优化作用，推测有氧运动与复合多糖灌胃干预二者对动物肠道菌群的影响趋势似乎并不一致。这与之前观察到的其对肥胖大鼠身体成分、血脂成分、血清炎性因子调节作用最差的结果一致[12]。

在菌科水平，6周有氧运动及复合多糖联合干预同样可使双歧杆菌科（Bifidobacterium）数量增加，提示其仍具备一定的对肠道菌群结构的正向促进调节作用[22]；在菌种水平，6周有氧运动及复合多糖联合干预可使布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）数量减少。

4 小结

与对照组相比，高脂膳食诱导肥胖大鼠肠道中促进肥胖的布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）数量显著增加，提示菌群组成改变可能是诱发肥胖的原因之一。

与肥胖对照组相比，有氧运动干预使大鼠肠道中可有效调节宿主代谢的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia mucinphila）、可调节宿主糖代谢的粪便普雷沃氏菌（Prevetella copri）数量显著增加。提示有氧运动干预可通过上调有利于机体代谢的肠道菌群组成以改善上述代谢表型。与肥胖对照组相比，复合多糖干预使大鼠肠道内可产生短链脂肪酸盐，有良好肠道保护作用的双歧杆菌属（Bifidobacterium）、别样棒菌属（Allobaculum）数量显著增加；而可导致肥胖的布氏瘤胃球菌（Ruminococcaceae bromii）数量显著减少。与肥胖对照组相比，有氧运动及复合多糖联合干预使大鼠肠道中可产生SCFA的别样棒菌属（Allobaculum）、布劳特氏菌属（Blautia）数量显著增加。

以上结果提示不同干预方式均可使大鼠肠道菌群组成发生相应改变，而上述肠道菌群的改变可能是影响血清相关指标及大鼠身体表型发生改变的原因。