湖北地区猪瘟病毒流行株E2基因的序列测定与分析

郭 锐，田永祥，周丹娜，刘 威，段正赢，杨克礼，刘泽文，袁芳艳，高 婷

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，湖北 武汉 430064；2.农业部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，湖北 武汉 430064；3.农业部兽用药物与诊断技术湖北科学观测实验站，湖北 武汉 430064；4.动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064）

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的猪瘟病毒（CSFV）所引起高热、出血和高死亡率为特征的接触性传染病[1]，被世界动物卫生组织（OIE）列入须申报的动物传染病目录，我国将其列为一类动物疫病。我国1954年成功研制出猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV），推广应用至今，较好地控制了猪瘟的大规模暴发和流行，免疫保护率一直在90%以上，但该病近几年在全国各地呈零星散发性流行，临床表现日趋复杂，必须引起我们兽医工作者的足够重视。

CSFV基因序列全长约12.3 Kb，病毒基因序列两端各有一个非编码区（5'-UTR和3'-UTR），非编码区中间仅有一个大的开放阅读框（ORF），能够编码3 898个氨基酸，其可构成12种蛋白质，有4个结构蛋白（C、Erns、E1、E2）和 8 个非结构蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。E2蛋白是CSFV最重要的结构性蛋白，也是最重要的功能性蛋白，是目前研究最为透彻的蛋白。在病毒感染宿主细胞的过程中，E2蛋白能与宿主细胞表面相应的特异性受体结合，介导病毒的侵入。虽然E2蛋白是CSFV最重要的保护性抗原，但它也是CSFV编码的所有蛋白保守性最差的一个，含有A、B、C 3个抗原结构域。这些区域中的一些与中和性密切相关的氨基酸序列或位点有着极高的突变频率，从而对E2蛋白整体的免疫原性产生影响，这可能也是造成疫苗株与野毒株免疫原性差异的根本原因。本试验旨在通过分析E2基因的遗传变化规律，从而了解湖北省地区CSFV流行毒株的变异情况，为猪瘟综合防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2017年3月29日至4月21日在湖北省农业科学院畜牧兽医研究所实验室进行。

1.2 材料

湖北省内疑似CSFV发病猪场，无菌采取剖检猪的脾脏、扁桃体、淋巴结等作为检测CSFV的材料；pMD18-T载体、DNA限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ、rTaq DNA、E.coli DH5α聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 病毒cDNA的合成

按照RNA提取试剂盒说明操作提取病毒RNA，再利用RNA反转录试剂盒合成cDNA，并-20℃保存。

1.4 引物设计与合成

引物参照GenBank已公布的HCLV株、Shimen株等CSFV参考毒株的E2基因组序列进行，上游引物 P1：5'-GCACAGGTCGTAAAGTTAGC-3'；下游引物 P2：5'-GTTGGATGTCAAAGCTGGTC-3'，预期扩增片段大小为1 489 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 CSFV E2基因的扩增

用1.3提取的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系体积为50 μL，其中10 μmol/L浓度的上下引物各 1 μL，模板 5 μL，2×EasyTaq PCRMix 25 μL，剩下添加 ddH2O 至 50 μL。反应程序：95 ℃预变性 5 min；95℃ 变性 30 s，62℃ 退火 30 s，72℃延伸 1.5 min，35个循环；72℃ 延伸 10 min。

1.6 CSFV E2基因的克隆及序列分析

将E2基因片段PCR产物回收，然后连接pMD18-T载体过夜，连接产物转化用DH5α感受态细胞，涂于含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜。从平板上挑取单菌落接种于3 mL含氨苄青霉素的LB培养液，37℃振荡培养过夜。用菌液提取质粒，进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定。将酶切鉴定为阳性的重组质粒送到上海生工生物工程有限公司测序，利用基因分析软件MegAlign 5.0对测序结果进行分析，参考毒株信息见表1。

表1 参考毒株信息

2 结果与分析

2.1 CSFV-E2基因的扩增

进行PCR扩增后得到1 489 bp的片段，与预期相符，见图1。

图1 CSFV-E2基因PCR扩增电泳结果

2.2 HBWH-2017-E2基因片段的基因氨基酸序列同源性分析

将HBWH-2017株和GenBank中公布的27个不同亚型CSFV毒株的E2基因氨基酸序列用Me gAlign 5.0软件进行分析，同源性在86.0%~96.0%，结果发现该毒株与湖南HNLY-2011株同源性高达96%，亲缘关系最近，属于同一分支2.1c亚型（图2）。

图2 HBWH-2017-E2基因氨基酸序列系统进化树

3 讨论

CSF是一种高度接触性、急性传染病，以高发病率、高死亡率、全身各脏器出血、高热稽留为主要特征，曾对我国养猪业造成严重经济损失。自从20世纪50年代我国科学家研发猪瘟兔化弱毒疫苗被广泛应用以后，CSF对我国养猪业的危害已显著降低。事实证明我国所使用的猪瘟兔化弱毒苗已经成为目前世界公认的最有效的猪瘟疫苗。但从近几年来全国各地的调查数据来看，CSF在我国并没有根除，这可能是由于长期使用疫苗产生的高免疫压力，迫使毒株向远离疫苗株方向进化[2]。

CSFV的E2糖蛋白是诱导动物机体产生中和抗体的主要保护性抗原。因此在CSFV的分子流行病学调查过程中常通过对其全基因或E2基因特定区域核苷酸序列及编码氨基酸序列进行测定和变异分析，然后构建遗传进化树追溯其起源。其中CSFV的E2蛋白N2端上第690~866位氨基酸为其主要抗原决定区，文献报道如第705、710、713~719、724、725、727、732 和 734 位的氨基酸发生变异，可导致特定单抗不能将其识别，即这些位点氨基酸与抗原决定簇有关[3-5]。本研究结果表明，与参考毒株HCLV株、Shimen株等27株毒株的E2基因编码氨基酸序列相比，HBWH-2017株属于2.1c亚型毒株，上述所说的11个氨基酸位点全部发生了变异，其中较为保守的713~719位点GGLTTTW，也变异为GGLYGCP。这些位点氨基酸变异可能导致抗原性差异，从而致使CSFV逃脱兔化弱毒株的免疫保护，导致免疫失败。要明确2.1c亚型猪瘟病毒的抗原性和毒力的变化及受到哪些氨基酸位点影响，还需进行更加深入的试验研究。

综上所述，目前我国CSFV流行毒株基因型主要有3种亚型，如山东地区流行2.1d亚型、辽宁地区2.1b亚型、福建地区2.1b和2.1c亚型、广西和广东地区2.1b和2.1c亚型、陕西地区2.1a亚型、湖南地区2.1b等，从主总体来看2.1b、2.1d、2.1c毒株已经成为我国现阶段CSFV的主要流行毒株。虽然目前我国流行的CSFV毒株以2.1b亚型占主导地位，但2.1c亚型新毒株的流行区域有不断扩散的趋势，今后我们应该加强对2.1c亚型毒株的监测和防控。