红花籽粕蛋白脱色工艺的初探

2018-08-10孙乾张爱琴李芳罗丰收孔令明

食品与发酵工业 2018年7期

孙乾，张爱琴，李芳，罗丰收，孔令明*

1(新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐，830052)2(新疆轻工职业技术学院，新疆乌鲁木齐，830021)

菊科植物红花是新疆特有的一种经济类作物，也是新疆民族特色药，其花、籽、茎、叶均可使用[1]。目前开发的主要用于活血化瘀等疾病的治疗[2]。红花籽粕是红花籽经制油后的副产品，籽粕中具有能清除DPPH自由基活性的物质和抗氧化性[3-5]，国内外对红花籽粕综合利用的研究甚少。

红花籽中含有红色素、黑色素等多种天然色素[6-9]，这在提取红花籽蛋白时会导致蛋白色泽较差。目前针对提取红花籽粕蛋白的研究较少，且关于红花籽粕蛋白颜色变化的机理性、程度性也尚不清楚[10-11]。脱色的目的是去除不必要的色素成分[12]。目前对于溶液类及其制品的脱色的方法较为常用的有：大孔树脂吸附法[13]、有机溶剂萃取法[14-15]、活性炭吸附法和双氧水氧化法[16-17]等。

双氧水属于强氧化剂，其脱色机理是：在水溶液中电解出相应的过氧氢根离子(HOO-)使样品中相应的基团发生变化而脱色[18]。双氧水脱色的总体效果较好，条件温和，残留杂质较少；但其相对具有较强的腐蚀性。超声波和微波作为辅助方法，常与双氧水合用，既缩短脱色时间，又能起到良好的脱色效果[19-20]。

活性炭属于表面吸附性物质。从凡华等[21]利用活性炭对马铃薯渣进行脱色时发现，活性炭对马铃薯渣的脱色效果较好。活性炭具有无毒、无臭、反复利用以及成本较低等特点。

臭氧也属于强氧化剂，是一种新型的、绿色的、环保的脱色方法，且在水溶液中易分解、无残留，但对水不溶性物质脱色较差[22]。此外，还有二氧化氯、次氯酸盐等脱色剂[23-24]。

对红花籽粕蛋白的脱色工艺进行研究，可提高其产品附加值，增加农民的收入，减少环境的污染，把红花籽精深加工提升一个空间，也使得红花籽、红花籽粕的综合性利用具有深远的产业和经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红花籽粕，新疆庄子实业有限公司；红花籽粕蛋白提取液，实验室自制；活性炭颗粒，天津市光复科技发展有限公司；H2O2，天津市致远化学试剂有限公司；牛血清蛋白，上海江莱生物科技有限公司；考马斯亮蓝，美国BIOSHARP公司；NaOH、HCl，均为分析纯，山东海化股份有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平，梅特勒-托利多仪器,上海有限公司；TDL-5-A低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；雷磁pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；DZKW-S-6数显式恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器有限公司；TU-1810PC紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；NH310高品质便携式电脑色差仪，深圳市三恩驰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 测定蛋白质的等电点

取红花籽粕蛋白提取液50 mL，用稀盐酸调节不同的pH值为：5.0、4.5、4.0、3.5和3.0，常温下静放一段时间，4 500 r/min，20 min离心，取离心后的上清液在紫外分光光度计下测定其蛋白含量，每一组做3个平行试验。以蛋白质在上清液中的残留量为指标，得出红花籽粕蛋白的最佳等电点(沉降点)。

1.3.2 活性炭的前处理

将活性炭颗粒融入1 mol/L的盐酸溶液中浸泡1 h，过滤后用温热蒸馏水进行冲洗，冲洗3～5次后放入鼓风干燥箱中105 ℃烘干备用。

1.4 红花籽粕蛋白提取液在活性炭作用下的脱色效果

准确量取蛋白提取液50 mL(制备方法同1.3.1)，加入不同含量的活性炭以及不同吸附时间的搅拌处理，4 500 r/min，10 min的离心，用考马斯亮蓝法测定蛋白的含量，并相应分析蛋白的损失率。用稀盐酸调节pH值，使之达到红花籽粕蛋白的等电沉降点。4 500 r/min，20 min离心，取酸沉物质，利用色差仪对蛋白的脱色效果进行测定。

按照以下公式进行计算：

(1)

式中：m，脱色后样液中减少的蛋白质的含量；M，脱色前样液中的蛋白质含量。

1.5 红花籽粕蛋白提取液在双氧水作用下的脱色效果

准确量取蛋白提取液50 mL(制备方法同1.3.1)，在不同含量的双氧水、不同的脱色温度、不同的吸附时间指标下，边搅拌边观察脱色效果，4 500 r/min，10 min离心。用考马斯亮蓝法测定蛋白的含量，并相应分析蛋白的损失率。用稀盐酸调节pH值，使之达到红花籽粕蛋白的等电沉降点。再次4 500 r/min，20 min离心，取酸沉物质，利用色差仪对蛋白的脱色效果进行测定。

1.6 脱色工艺的优化

对红花籽粕蛋白的色素脱除分别用活性炭吸附和双氧水漂洗2种方法，将试验的结论与空白对照样本进行多重比较，进行差异性评比分析。

2 结果与分析

2.1 测定红花籽粕蛋白的等电点

由图1曲线趋势可以得出，在一定指标范围内，随着pH值的增大，曲线呈现出先急剧下降后快速上升。由此可以说明，蛋白质对酸性较为敏感，当pH值降低到3.0左右时，籽粕中的酸性蛋白解离性加速；在pH值为3.5～4.5时，红花籽粕蛋白达到沉淀时的平衡状态；当pH大于5.0时，红花籽粕蛋白的溶解度剧增，因此选取pH 4.0作为红花籽粕蛋白的最佳等电点。

图1 红花籽粕蛋白最佳等电点Fig.1 The best isoelectric point of sunflower seed meal protein

2.2 红花籽粕蛋白提取液在活性炭中脱色分析

2.2.1 活性炭添加量对脱色率的影响[25]

准确量取蛋白提取液50 mL，加活性炭5%、10%、15%、20%、25%和30%并适度搅拌处理60 min，离心机4 500 r/min，10 min离心，用考马斯亮蓝法测定蛋白的含量，并相应分析蛋白的损失率。用稀盐酸调节pH值，使之达到红花籽粕蛋白的等电点。室温下静放一段时间，4 500 r/min，20 min离心，取酸沉物质。将所得酸沉物质放于载玻片上，使用色差仪对其色亮反应比色，其比色反应见表1。

表1 活性炭添加量对蛋白损失率及脱色效果的影响Table 1 Effect of activated carbon on protein loss rateand decolorization

由表1数据可以得出，在一定指标范围内，随着活性炭添加量的增大，脱色效果显著。当活性炭的添加程度达到20 g(样液的1/5时)，添加量与脱色效果不再具有一定的相关性；若添加度达到25 g和30 g时，提取液中蛋白的损失便成倍增长，远超过80%甚至近100%，且脱色效果不明显。随着红花籽粕蛋白提取液脱色率的不断升高，蛋白质的损失率也相应的成倍增长。因此，选择20%的活性炭添加量。

2.2.2 脱色时间对脱色率的影响

准确量取蛋白提取液50 mL，加入含量20%的活性炭，选定15、30、45、60、75和90 min几个脱色时间段。用考马斯亮蓝法测定蛋白的含量，并相应分析蛋白的损失率。用稀盐酸调节pH值，使之达到红花籽粕蛋白的等电点。室温下静放一段时间，4 500 r/min，20 min的离心，取酸沉物质。将所得酸沉物质放于载玻片上，使用色差仪对其色亮反应比色，其比色反应见表2。

表2 活性炭脱色时间对蛋白损失率及脱色效果的影响Table 2 Effect of decolorization time of activated carbonon protein loss rate and decolorization

由表2数据可以得出，在75 min时，活性炭的脱色效果趋于平稳，蛋白损失率亦达到平衡，不再有较明显的损失。因此，选择活性炭脱色时间为75 min。

2.3 红花籽粕蛋白提取液在双氧水中脱色分析

2.3.1 双氧水添加量对脱色率的影响[26]

准确量取蛋白提取液50 mL，加双氧水1%、2%、3%、4%和5%并适度搅拌处理60 min，离心机4 500 r/min，10 min离心，测定、分析蛋白含量及损失率。用稀盐酸调节pH值，使之达到红花籽粕蛋白的等电点。室温下静放一段时间，4 500 r/min，20 min离心，取酸沉物质。将所得酸沉物质放于载玻片上，使用色差仪对其色亮反应比色，其比色反应见表3。

表3 双氧水添加量对脱色的影响Table 3 Effect of adding amount on decoloration

由表3数据可以得出，随着双氧水添加量从2%～5%，籽粕蛋白所呈现的明亮度也在平稳中有所升高。当添加4%的双氧水时，蛋白由深色(墨绿)渐渐转为浅色(偏红色)；此时的蛋白损失率也呈现出缓慢增长的趋势。当继续添加双氧水时，红花籽粕蛋白的颜色变化不再明显，而此时蛋白的损失率突然增高。因此，选择双氧水添加量为4%(体积分数)。

2.3.2 双氧水温度对脱色率的影响

准确量取蛋白提取液50 mL，加双氧水稀释液，在时间1 h范围内，选择常温(20 ℃)、30、40、50和60 ℃几个温度阈值。4 500 r/min，10 min离心，测定、分析蛋白含量及损失率。用稀盐酸调节pH值，使之达到红花籽粕蛋白的等电点。室温下静放一段时间，4 500 r/min，20 min离心，取酸沉物质。将所得酸沉物质放于载玻片上，使用色差仪对其色亮反应比色，其比色反应见表4。

表4 脱色温度对脱色的影响Table 4 Effect of decoloration temperature on decoloration

由表4数据可以得出，在一定指标范围内，随着脱色温度从30～60 ℃，籽粕蛋白所呈现的明亮度也在平稳中有所升高。当温度为50 ℃时，亮度有所下降，这可能由于温度的升高使得双氧水在一定程度上发生了一定的解离反应，从而造成了双氧水中有效的溶质量较少，与此同时蛋白的损失也在大幅度增加；当脱色温度为60 ℃时，亮度虽在一定程度上有所提高，但此时会引起部分蛋白质产生一定的变性，从而会一定程度上影响红花籽粕蛋白的功能特性。因此，在既不让蛋白变性受到更大的损失，又不浪费资源的情况下，选择双氧水脱色温度为40 ℃。

2.3.3 脱色时间对脱色率的影响

准确量取蛋白提取液50 mL，加双氧水稀释液，在脱色温度为40 ℃时，选定30、40、50、60和70 min几个脱色时间段。离心机4 500 r/min，10 min离心，测定、分析蛋白含量及损失率。用稀盐酸调节pH值，使之达到红花籽粕蛋白的等电点。室温下静放一段时间，4 500 r/min，20 min的离心，取酸沉物质。将所得酸沉物质放于载玻片上，使用色差仪对其色亮反应比色，其比色反应见表5。

表5 脱色时间对脱色的影响Table 5 Influence of decoloration time on decoloration

由表5数据可以得出，在一定指标范围内，随着脱除色素时间从30～70 min，籽粕蛋白所呈现的明亮度也在平稳中有所升高。脱色时间在1 h时亮度达到最佳，继续延长脱色时间，其脱色效果并不十分显著，蛋白的损失一直呈现缓慢的增长趋势，变化不明显。因此，选择双氧水脱色时间为60 min。

2.4 红花籽粕蛋白在不同处理方法时的对比分析

依照活性炭和双氧水法可以得出红花籽粕的最佳脱色条件，用此最佳条件，对红花籽粕蛋白进行脱色，运用SPSS 18.0软件的最小显著差异法多重比较，其结果见表6。

表6 红花籽粕蛋白在不同处理方法时的对比结果(LSD)Table 6 Comparison of sunflower seed meal protein indifferent treatment methods(LSD)

注：同一列的不同字母给出了差异性不同表示(p<0.05)。

由表6数据可以得出，红花籽粕蛋白经活性炭与双氧水处理后的脱色效果显著。

活性炭表面疏松多孔，对小分子类物质有极强的吸附功能。由于是对红花籽溶液进行吸附脱色，一些色素类会附在蛋白质上，与蛋白质相结合，对这种结合的分离比较困难且效果不明显。因此在吸附色素的同时，也会吸附一定量的蛋白质，从而造成蛋白质的大量损失。双氧水是一种常用的食品类漂白剂，具有极强的氧化性，能将有色物质氧化成醛类或羧酸类物质，而被氧化的醛、羧酸类物质即可从吸附蛋白上脱离出来，这对蛋白质的脱色有较为明显的效果。