CN128中残留有机溶剂的顶空GC法测定

马 丽 余露山

(浙江大学药学院药物分析教研室 杭州 310058)

CN128是由浙江大学药学院药物研究所自主研发,于2017年经CFDA批准进入临床研究的一类新药。CN128作为祛铁药物,适用于重型β型地中海贫血症患者因治疗过程中铁元素随输血进入体内产生的铁过载症,从而降低重型β型地中海贫血症患者因铁元素在心脏、肝、脾等脏器积累而造成的相应脏器损伤、衰竭,甚至死亡[1-3]。根据中国药典2015年版第四部通则0861中的规定,应在CN128最终产物中检测药物生产过程中用到的所有有机溶剂的残留量[4]。据此本研究建立了顶空GC法测定CN128中可能残留的7种有机溶剂(乙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、环己烷和正庚烷)以及起始物料(氯化苄),共计8种。

材 料 和 方 法

仪器美国安捷伦6890N型气相色谱仪和7694E型顶空进样器。

试药CN128原料药(浙江大学药学院自制,含量99.97%、98.62%和98.79%,批号:20121216、20121228和20130115);乙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、环己烷、正庚烷和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和氯化苄均为分析纯(国药集团)。

顶空GC测定方法色谱柱为Agilent HP-5毛细管色谱柱(5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷,30 m×0.25 mm×0.25 μm);检测器为氢火焰离子化检测器(FID);检测器温度250 ℃;程序升温起始温度为35 ℃,保持6 min,以50 ℃/min升温至110 ℃,再以10 ℃/min升温至220 ℃,保持3 min;进样口温度200 ℃;载气氮气;流速1.0 mL/min;分流比1∶1;进样时间1 min。

溶液配制

定位溶液 分别精密称取乙酸乙酯100 mg、二氯甲烷12 mg、乙醇100 mg、乙腈10 mg、正己烷5 mg、正庚烷95 mg、环己烷80 mg和氯化苄20 mg,置于装有适量DMF的100 mL量瓶中,用DMF定容至刻度,摇匀,即得。

选择性试验溶液 精密称取乙酸乙酯100 mg、二氯甲烷12 mg、乙醇100 mg、乙腈10 mg、正己烷5 mg、正庚烷95 mg、环己烷80 mg和氯化苄20 mg,加入装有适量DMF的100 mL量瓶中,用DMF定容至刻度,摇匀,即得。

对照系列溶液 精密称取乙酸乙酯500 mg、二氯甲烷60 mg、乙醇500 mg、乙腈50 mg、正己烷25 mg、正庚烷475 mg、环己烷400 mg和氯化苄100 mg,迅速加入已装有适量DMF的10 mL量瓶中,定容至刻度,摇匀,得对照储备溶液。精取上述对照储备溶液1 500 μL,用DMF稀释至50 mL,作为标准待测液1;精取标准待测液1 830 μL,用DMF稀释至1 mL,作为标准待测液2;精取标准待测液1 750 μL,用DMF稀释至1 mL,作为标准待测液3;精取标准待测液1 500 μL,用DMF稀释至1 mL,作为标准待测液4;精取标准待测液1 330 μL,用DMF稀释至1 mL,作为标准待测液5。以上系列标准待测液中各有机溶剂的浓度分别为:乙酸乙酯0.495、0.750、1.125、1.240和1.500 mg/mL,二氯甲烷0.060、0.090、0.135、0.149和0.180 mg/mL,乙醇0.495、0.750、1.125、1.240和1.500 mg/mL,乙腈0.040、0.060、0.090、0.010和0.120 mg/mL,正己烷0.029、0.044、0.065、0.072和0.087 mg/mL,正庚烷0.495、0.750、1.125、1.240和1.500 mg/mL,环己烷(0.380、0.580、0.870、0.960和1.160 mg/mL)和氯化苄0.099、0.150、0.225、0.249和0.300 mg/mL。

供试品溶液 取CN128约0.2 g,置顶空瓶中,加DMF溶液1.0 mL,压盖,溶解后摇匀,作为供试品溶液。照上述色谱条件顶空进样测定。

结 果

专属性试验分别取定位溶液和限量对照溶液,按“顶空GC测定方法”项下色谱条件进样,记录色谱图(图1B)。结果表明,空白溶剂无干扰;各残留溶剂均能有效分离,相邻溶剂峰之间的最小分离度(乙醇和乙腈)为2.5,符合验证方案要求(分离度≥1.5),结果见表1。

线性与检测限、定量限试验分别取对照系列溶液,按“顶空GC测定方法”项下色谱条件进样,以峰面积为Y值,标准品浓度为X值,计算各有机溶剂的回归方程及相关系数。采用逐步稀释法,以信噪比为3(S/N=3)测得各有机残留溶剂的最低检测限(limit of detection,LOD),以信噪比不小于10(S/N≥10)测得各有机残留溶剂的最低定量限(limit of quantity,LOQ),结果见表2。

A:Blank;B:Selective test solution (1-ethanol,2-acetonitrile,3-dichloromethane,4-hexane,5-ethyl acetate,6-cyclohexane,7-heptane,8-DMF,9-benzyl chloride);C:Test solution.

图1 典型色谱图Fig 1 Typical chromatograms

精密度试验选择性试验溶液平行配制5份,按“顶空GC测定方法”项下色谱条件进样,计算各残留溶剂峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD),要求RSD≤5.0%,结果见表3。

回收率试验精密称取本品0.2 g,置顶空瓶中,分别加入上述线性标准待测液1 830、750和500 μL,用N,N-二甲基甲酰胺稀释至1 mL,压盖,溶解后即得回收率试验溶液。照上述条件测定,每个浓度测定3份。结果显示,乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醇、乙腈、正己烷、正庚烷、环己烷和氯化苄的平均回收率分别为110.67%、98.22%、98.58%、115.40%、110.22%、116.85%、108.01%和111.86%;RSD分别为0.69%、1.04%、0.37%、1.31%、1.46%、0.98%、1.00%和4.27 %。

表2 线性试验结果,LOD及LOQTab 2 Results of linerarity test,LOD and LOQ

LOD:Limit of detection;LOQ:Limit of quantity.

样品测定取供试品溶液,按“顶空GC测定方法”项下色谱条件进样,记录色谱图(图1C)。结果表明,3批样品中均未检出乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、正庚烷、环己烷和氯化苄;乙醇残留含量为0.004%、0.004%及0.004%;乙腈残留含量为0.013%、0.023%及0.023%。

表3 精密度试验结果Tab 3 Results of precision

讨 论

考察基质对残留溶剂的影响采用标准加入法和外标法对所测有机溶剂做线性方程,并依据标准加入法所得线性方程计算加样回收率,计算所得的乙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、环己烷、正庚烷的加样回收率在80%～120%,说明样品基质对残留溶剂的挥发没有影响,因此采用外标法测定供试品中残留溶剂含量是可行的。

顶空条件优化分别考察了顶空瓶平衡温度(80、90、100和120 ℃)和顶空瓶平衡时间(30和45 min)对各残留溶剂灵敏度的影响。结果表明,80 ℃时对照品溶液中未检测到氯化苄;90和100 ℃时对照品溶液中各峰的峰面积没有明显区别,120 ℃时二氯甲烷峰面积不稳定。因此最终选择顶空瓶平衡温度为90 ℃;两个平衡时间下对各溶剂的色谱峰峰面积没有明显区别,因此最终选择顶空瓶平衡时间为30 min。