沉香的化学成分及鉴伪技术研究进展

陈虹霞, 康秀棠, 尤龙杰, 王成章,3*

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室， 江苏 南京 210042； 2.福建省香产品质量检验中心， 福建 泉州 362600； 3.中国林业科学研究院 林业新技术研究所， 北京 100091)

沉香(AquilariaeresinatumLignum)为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属植物沉香和白木香含有黑色树脂的木材，是传统的名贵中药材和天然香料，主要分布在中国、日本、印度、中东、东南亚等国家[1]。目前发现的瑞香科中有19种沉香属树种，但能产沉香的只有4种，分别为马来西亚沉香(Aquilariamalaccensis)、奇楠沉香(Aquilariacrassna)、土沉香(Aquilariasinensis)和菲律宾沉香(Aquilariafilaria)[2-3]。沉香作为传统中药在我国使用悠久，临床上主要用于治疗肺心病、冠心病、脑溢血、胃寒和哮喘等疾病[4-6]。沉香除了药用价值，还具有很高的收藏价值。近年来，由于受到自然灾害和人为滥采滥伐的影响，沉香资源越来越匮乏，导致沉香价格节节攀升，同时劣质沉香和掺假沉香充斥市场，严重损害了消费者的利益。因此，笔者针对沉香行业目前的现状，对国内外沉香的化学成分、检测方法和鉴伪技术的研究进展进行综述，比较现阶段沉香鉴伪技术的特征和适用性，以期为沉香产品质量标准的建立和行业发展提供借鉴依据。

1 沉香化学成分

根据国内外的报道，沉香的化学成分主要包括挥发油、 2-(2-苯乙基)色酮类和三萜类等。

1.1 挥发油

挥发油中主要是倍半萜类化合物以及少量简单的挥发性化合物和脂肪酸类化合物。目前发现的倍半萜化合物共有70多种，根据其骨架类型，可分为呋喃型、螺旋烷型、桉烷型、愈创木烷型、杜松烷型、艾里莫酚烷型和前香草烷型等[7-9]，各类型典型化合物的结构如图1所示。挥发性化合物主要为芳香族化合物，如萘、呋喃甲醛、香豆酮、二氢香豆素、 2-苯乙基-苯、 4-苯基-2-丁酮和苄基丙酮等[3]。脂肪酸类成分主要包括棕榈酸、硬脂酸、十八碳-9-烯酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、油酸、亚油酸和十八碳三烯酸等[10-12]。

不同品种沉香挥发油主要成分质量分数差异较大，马来西亚沉香挥发油中主要成分为芳香族，含有32.1%的4-苯基-2-丁酮，6.5%的沉香艾里莫醇和5.8%的沉香愈创木烯[13]；奇楠沉香挥发油主要成分为倍半萜类化合物，其中白木香醛和α-愈创烯的质量分数最高，分别为36.31%和14.12%，其次是艾里莫芬-7(11),9-二烯-8-酮(4.66%)、檀香醇(3.80%)、α-沉香呋喃(3.18%)、α-古云烯(2.17%)、α-蛇麻烯(2.02%)、苍术醇(2.01%)和沉香螺旋醇(1.73%)[14]；土沉香挥发油主要成分为倍半萜类化合物和芳香族类化合物，其中苄基丙酮的质量分数最高，为19.51%，其次为α-古巴烯-11-醇(6.24%)、环氧化红没药烯(4.68%)、马兜铃酮(4.06%)、蛇床烯(3.49%)、石竹烯氧化物(3.39%)和荜澄茄油烯醇(3.30%)[15]。

图1 沉香中倍半萜骨架典型结构Fig. 1 Typical structures of sesquiterpenes from agarwood

1.2 2-(2-苯乙基)色酮类

2-(2-苯乙基)色酮类化合物是沉香中除了倍半萜类化合物之外的另一种标志性化合物，目前从沉香中分离鉴定的色酮类化合物有80多种，包括沉香四醇、异沉香四醇、 2-(2-苯乙基)色酮和2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮等类型[16-17]，如图2所示。奇楠沉香中主要含有2-(2-苯乙基)色酮和2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮，不同色泽、不同产地的奇楠沉香的色酮类含量差异较大，通过GC-MS分析了5种奇楠沉香样品的乙醚提取物，其中海南白奇、海南紫奇、海南绿奇、越南绿奇和海南黄奇乙醚提取物中2种色酮的质量分数之和分别为66.47%、 82.09%、 84.71%、 71.98%和16.09%[18-19]。Yagura等[20]从土沉香中分离鉴定了4种色酮类化合物，分别为5-羟基- 6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、 6-羟基-2-(2-羟基-2-苯乙基)色酮、 6,7-二羟基-2-(2-苯乙基)-5,6,7,8-四氢色酮和8-氯-2-(2-苯乙基)-5,6,7-三羟基-5,6,7,8-四氢色酮。Wu等[21]从马来西亚沉香中分离鉴定了6-甲氧基-2-(4′-甲氧基-2-苯乙基)色酮、 8-氯-2-(4′-甲氧基-2-苯乙基)-5,6,7-三羟基-5,6,7,8-四氢色酮、 8-氯-2-(3′-羟基- 4′-甲氧基-2-苯乙基)-5,6,7-三羟基-5,6,7,8-四氢色酮、 5,6,7-三羟基-2-(2-苯乙基)-5,6,7,8,8-五氢色酮等8种色酮化合物。Suzuki等[22]从菲律宾沉香中分离鉴定了2-(2-羟基-2-苯乙基)色酮、 4′,7-二甲氧基- 6-羟基色酮、 4′,6-二羟基-2-(2-苯乙基)色酮等11种色酮类化合物。

图2 典型的2-(2-苯乙基)色酮类化合物Fig. 2 Typical 2-(2-phenylethyl)chromone compounds

1.3 三萜类

从沉香中分离得到的三萜类成分包括羟基何帕酮[23]、春藤皂苷元[24]、木栓烷醇、表木醛醇、软木三萜酮、角鲨烯、 2α-羟基熊果酸和2α-羟基熊果烷[25]，其中典型化合物的结构如图3所示。

图3 典型的三萜类化合物Fig. 3 Typical triterpenoids compounds

2 沉香品质检测和鉴伪技术

2.1 概述

传统上的沉香品质评价都采用物理评价方式，如沉香树脂含量、水中下沉程度、色泽、气味、火试和显微鉴别等，其中沉香树脂含量是评价沉香品质最通用的方法[26]。但是使用这些方法去鉴别和检测沉香品质还存在一定难度。随着科学技术的发展，现代化的分析检测手段也被用来定性和定量分析沉香品质，如：基于色泽分析的图像处理系统[27]，基于化学成分分析的薄层色谱[1,28]、紫外光谱[29-30]、气相色谱-质谱联用(GC-MS)[31-33]、高效液相色谱(HPLC)[34-37]、X射线衍射光谱(XRD)[38]、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)[39-40]、近红外光谱(NIR)[41]等检测方式，基于气味分析的电子鼻检测[42-43]，基于核酸和蛋白质的基因组学和蛋白质组学技术[44-45]。

2.2 基于化学成分分析的检测方法

2.2.1薄层色谱 薄层色谱是以硅胶、氧化铝等吸附剂作为固定相，用不同极性溶剂为流动相，将样品展开后进行分析和分离的方法，具有成本低、耗时短的优点，适合用于天然活性物质的提取分离及定性鉴别。2010年版《中国药典》规定了沉香的薄层色谱鉴别方法：取样品和沉香粉末各0.5 g，加乙醚30 mL，超声波处理60 min，过滤，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷2 mL溶解，作为供试品溶液和对照药材溶液，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷/乙醚(体积比10∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置365 nm紫外光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点[1]。李志俊等[28]取沉香伪品、国产沉香和进口沉香粉末各0.2 g，用1 mL丙酮浸泡约30 min，时时振摇，取浸出液作为点样供试品，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯/丙酮(体积比9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，用0.5%香草醛硫酸溶液进行喷洒显色，其中国产沉香和进口沉香均有斑点，但伪品沉香在相应显色处不存在斑点。薄层色谱的鉴别主要通过化学物质在薄层板上的比移值来确定，通过对特征性斑点比移值的对比分析，可以初步确定沉香真伪，但是如果人为的掺入比移值与之相似的化合物，就很难判断真伪，因此需要与其他色谱手段联合鉴别。

2.2.2紫外光谱 紫外光谱检测是根据样品中化合物对紫外光的吸收差异而产生形态、峰位和峰强度等不同的吸收光谱来进行鉴别。黄如栋等[29]在200～300 nm波长范围内对不同沉香样品的吸光度进行测量，对比分析了进口沉香和伪品沉香的紫外峰形、峰位、相同吸收峰强度等数值，2类沉香存在显著差异，进口沉香在206、 209、 222、 237和315 nm处有最大吸收峰，而伪品沉香在206和242 nm处有最大吸收峰，并且其谷位差异较大。李劲松[30]采用紫外光谱法对比分析了国产沉香、野生沉香和人工沉香，结果表明：国产沉香在(206±2)、(216±2)、(226±2)，(248±2)、(252±2)和(261±2)nm处具有共同吸收峰；野生沉香在(219±1)、(229±1)、(247±1)和(251±2)nm处具有共同吸收峰；人工沉香由于结香方式不同，具有一定的差异性，凿洞法和打钉法在203、(217±2)、(230±2)和248 nm处具有共同吸收峰，而输液法在207 nm处有吸收峰。然而，不同沉香样品的紫外光谱图存在很大的相似性，且不同品种或不同结香方法的紫外光谱图仅存在细微的差异，因此采用紫外光谱法鉴别沉香品质还存在一定的局限性。

2.2.3气相色谱-质谱联用 气相色谱-质谱联用是测定样品中挥发油和植物油等化学成分的最主要分析方法，具有柱效高、灵敏度高、鉴定速度快和分离能力强等特点，广泛应用于易挥发性化合物的化学组成分析。倍半萜和色酮类化合物是沉香中典型的化合物，其种类和含量的变化决定了沉香的香气和品质。杨锦玲等[31]采用GC-MS分析了越南红土沉香、黄熟香和吊口沉香3种越南产沉香的化学成分，发现红土沉香中2-(2-苯乙基)色酮和2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮的GC含量之和高达51.57%，其化学组成与奇楠沉香接近。Gao等[32]通过GC-MS对沉香中22种化学成分质量变化进行分析，表明人工诱导时间和结香方法会不同程度导致沉香中倍半萜类化合物缓慢增加，而色酮类化合物快速增加。通过甲酸和真菌接种的结香方式，沉香的化学组成与天然结香的最为接近。吴惠勤等[33]通过固相微萃取(SPME)富集沉香的气味成分，GC-MS分析天然沉香的6种特征成分(苄基丙酮、对甲氧基苄基丙酮、沉香呋喃、沉香螺旋醇、茅苍术醇、白木香醛)，通过沉香样品中气味成分的种类及其相对含量与天然沉香特征成分对比，判断沉香的真伪。因此通过沉香特征化学成分和指纹图谱的对比分析，可用来鉴别人工沉香和天然沉香。

2.2.4高效液相色谱 高效液相色谱法是以液体为流动相的色谱技术，通过对色谱柱、流动相洗脱体系和流速等条件的控制，进行高效分离和灵敏分析，具有分析速度快、样品消耗少和操作简单等特点。相比气相色谱而言，高效液相色谱对沉香化学成分的分析会更全面，特别是沉香中不易挥发的化合物。张倩等[34]建立了沉香药材高效液相色谱-二极管列阵检测器(HPLC-DAD)的9个特征峰图谱，选用Diamonsil C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色谱柱；0.1% 甲酸水(A)-乙腈(B)为流动相，洗脱梯度：0～10 min，15%～20%B；10～19 min，20%～23%B；19～21 min，23%～33%B；21～39 min，33%B；39～40 min，33%～35%B；40～50 min，35%B；50～50.1 min，35%～95%B；流速0.7 mL/min；柱温30 ℃;检测波长为 252 nm。陈亚[35]对比分析了11种沉香的HPLC色谱图，最终确定了沉香药材的12种特征峰，其中6-羟基-2-[2-(4′-甲氧基苯)乙基]色酮的质量分数为0.0268%～0.0621%，6-羟基-2-(2-苯乙基)色酮的质量分数为0.101 0%～0.148 6%。戚树源等[36]和何梦玲等[37]通过HPLC建立了色酮类成分的测定方法。采用HPLC可以快速分析沉香中化学成分，通过对几种特征峰的变化和含量分析，可以用来鉴别和控制沉香质量。但其鉴别的前提是必须有标准化合物进行标定分析，目前建立的HPLC分析方法中，可供参考的化合物均为自制，市场上还没有可供HPLC分析的标准化沉香特征化合物。

2.2.5X射线衍射 X射线衍射是根据衍射图谱的几何拓扑规律、峰形的特征值和模糊图象识别原理而建立起来的现代鉴定分析方法，可以从另一个角度综合分析控制药材的质量，具有快速、简便、图谱信息量大和指纹性强等优点[46]，广泛应用于中药材的鉴定和质量控制[47-48]。李劲松等[38]采用XRD技术对国产沉香与白木香进行分析，建立国产沉香X射线衍射Fourier指纹图谱,通过对国产沉香药材和白木香X射线衍射图谱进行计算和分析，8批国产沉香的相似度在0.909 6～0.960 1之间，而白木香与国产沉香的相似度较低，其2θ在10～20°之间也有明显差异。目前采用X射线衍射法鉴定沉香的研究还不系统，只是采用聚类分析对几种国产沉香的一致性进行了考察，缺乏更加系统的沉香XRD数据库，包括不同品种、不同产地等。

2.2.6傅里叶变换红外光谱 傅里叶变换红外光谱是根据干涉后的红外光进行傅里叶变换后得到的单光束光谱，由样品本身的化学结构、电子云分布和几何构型等决定了样品的结构特征，从而给出不同的频率、峰强和带隙。于玥等[39]采用傅里叶红外光谱法和二阶导数光谱法建立了4种沉香的特征吸收峰，其中，1244 cm-1是黄棋特征峰；1650、 1384、 1246、 1122、 849、 781、 759 cm-1是绿棋特征峰；1602、 1103、 1034、 861和750 cm-1是黑棋特征峰；1638、 1601、 1388、 1272、 1246、 1122、 1032、 965、 847、 780和758 cm-1是紫棋特征峰。Qu等[40]通过对沉香、掺假物质(松香树脂、纤维素和木质素等)进行傅里叶变换红外光谱和二维相关红外谱图的计算和分析，建立了一种快速简便的沉香掺假筛选模型，该方法准确、便捷，可应用于沉香中掺入松香树脂和廉价木材的快速鉴别。目前对沉香的傅里叶变换红外光谱分析还处于初级阶段，采用原光谱和二阶导数光谱进行了结构分析、聚类分析和偏最小二乘法判别分析等，如果需要分析沉香的掺假样品，需要建立更多的沉香样品和可疑掺假样品的傅里叶红外光谱，建立沉香的傅里叶红外光谱特征数据库，从而判断是否掺假。

2.2.7近红外光谱 近红外光(780～2 526 nm)是指波长介于可见光区与中红外光区之间的电磁波，是由分子振动能级的跃迁而产生的，反映含氢基团C—H、O—H、S—H、N—H等振动的倍频和合频吸收，其特征是快速、无需前期预处理且无损样品。钟建理等[41]分析了53批沉香样品，采用二阶导数法和因子化法建立沉香掺伪品鉴别模型，通过验证发现该方法可快速、准确地鉴别出伪劣沉香。目前，近红外光谱技术已成功应用于食品基质分析，但是在沉香掺假的检测方面还处于起步阶段，对掺假体系的建立还不够健全。

2.3 电子鼻

电子鼻技术应用于鉴伪始于20世纪90年代，它模拟了人的嗅觉系统，是一种新颖的分析、识别和检测具有气味或挥发性成分的仪器。Najib等[42]利用电子鼻分析不同品质的马来西亚和印度尼西亚沉香，建立人工神经网络系统，并用LMBP模式识别算法，正确率达100%。李志远[43]利用电子鼻和主成分分析法(PCA)研究了沉香和伪劣沉香的电子鼻信息变化特征，采用反向传播、径向基函数、广义回归、概率神经网络和学习向量量化神经网络对相应验证组数据进行判别，经参数优化后准确率可达96.3%。利用沉香气味或挥发性成分分析探索掺假沉香或伪劣沉香的电子鼻信息特征变化规律，建立沉香模式识别方法，可提供快速判别的可能性。然而，实际应用于沉香鉴别，还存在一定难度，首先电子鼻仪器价格高昂，其次仪器具有漂移性会影响检测结果，另外需要大量的沉香样本建立指纹图谱库，但是沉香品种、产地和结香方式等都可能会影响沉香香气的变化，因此建立一套全面的沉香指纹图谱库存在一定的难度。

2.4 分子生物学技术

基于核酸和蛋白质的基因组学和蛋白质组学技术是鉴别食品和农业掺假的主要技术手段。近年来，对沉香生物合成途径的研究取得了很多研究成果。Kumeta等[49]通过构建沉香悬浮细胞DNA文库，首次从中克隆出沉香愈创木烷型倍半萜合成酶基因。Xu等[50]获得了主产物为愈创木烯型的倍半萜合成酶蛋白。Lee等[44]采用实时聚合酶链反应(PCR)-单核甘酸多态性(SNPs)技术检测马来西亚沉香、奇楠沉香和土沉香，结果表明采用PCR技术能够有效区分这3种沉香。高晓霞等[45]探讨不同品种沉香间的rDNA ITS2序列差异及系统发育分析，结果发现：沉香种内平均K2P遗传距离为0～0.003，种间平均K2P遗传距离为0.005～0.023，白木香、人工沉香和商品沉香在系统发育树上聚为一支，基于ITS2条形码序列可以准确鉴别沉香基源植物。钟志敏等[51]建立了适用于提取不同沉香药材DNA的方法，通过ITS2序列对沉香药材进行种质资源聚类分析，ITS2序列能准确鉴别出4个沉香混伪品和2个似沉香物种，15个沉香样品ITS2序列与泰国沉香、奇楠沉香、土沉香3个沉香物种100%相似，表明通过对沉香DNA条形码的研究可以用来鉴别沉香资源。采用分子生物学方法用于沉香鉴伪的优势在于特异性好、灵敏度高，能够有效辨别沉香掺假率，但是其前期预处理较复杂，检测成本较高。

3 结 语

沉香的品种繁多，其品质因产地和结香方式的不同存在很大差异，同时受到沉香巨大的价格诱惑，以次充好、以假乱真的沉香比比皆是，因此鉴伪技术的研究为有效区分沉香品质、打击不法行为提供了不可或缺的科技支撑。通过对现代化分析检测手段研究发现，薄层色谱和紫外光谱是快速鉴别的主要手段，但是这2种方法的精准度不够，需要与其他色谱方法相结合，如气相色谱-质谱法和高效液相色谱法等，才能达到理想的鉴别效果；近红外光谱、X射线衍射、傅里叶变换红外光谱和电子鼻技术都是基于样品特征性谱图库数据的建立而进行的快速鉴别工具，具有快速无损等特点，但是目前这些技术还处于实验研究阶段，实际应用还需要大量的数据分析和模型建立为支撑；分子生物学的检测手段最为精准，也是国际上仲裁食品、农产品等鉴伪检测的主流方法，但实际检测过程中成本较高。因此，从长远来看，基于样品特征性谱图库数据建立的快速鉴别技术及其多种技术结合使用的方式将是未来沉香鉴伪技术的发展趋势。